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荧光定量PCR技术研究进展及其应用 刘畅 （桂林理工大学 环境学院，广西 桂林 541006） 摘要：实时荧光定量 PCR 技术作为一项新兴技术，越来越受到人们的重视，它以快速、准确定量、便捷等优点广泛应用于科学研究各个领域。文章综述了荧光定量PCR技术的基本原理、分类情况以及其在植物学、医学和环境研究等领域的应用。 关键词：荧光定量PCR；荧光染料；荧光探针；植物学；环境；医学 中图分类号：Q812 文献标识码：A 1 引言 聚合酶链反应( PCR) 是一种在生物体细胞外通过酶促合成特异DNA或DNA片段的方法，又称多聚酶链反应、无细胞克隆技术等[1]，由美国Perkin-Elmer Cetus公司人类遗传研究室Mullis等于1985年发明。它利用DNA聚合酶对特定基因在体外或试管内进行大量合成。其基本的工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核营酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照碱基互补配对原则沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。不断重复这一过程，可使目的DNA片段得到扩增。因为新合成的DNA也可作为模板，因而PCR可使DNA的合成量呈几何指数增长，达到原来的一百亿至一千亿倍。 1992年，Higuchi等在PCR反应管中加入EB，实时观察EB与DNA双链结合发出的荧光强度随PCR产物增加的变化，以此定量PCR产物，实现了最早的实时定量PCR。1996年，美国Applied Bio systems公司推出了成熟的实时荧光定量PCR (real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR)技术。之后随着研究的不断深入，科研人员又设计出各种不同的荧光探针，由于其具有的特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、速度快、全封闭反应等优点，使得该技术在科学研究中得到广泛应用[2]。 2 实时荧光定量PCR技术原理 FQ-PCR是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板的定量及定性分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。x-轴表示PCR循环数， y-轴表示扩增反应的荧光值，与反应管中扩增产物的量有比例关系。扩增曲线有指数增长期和非指数平台期2个阶段。在指数增长阶段，每个循环PCR产物量大约增加一倍。然而随着反应的进行，反应体系组成成分的消耗，反应进入平台期(图1中28~40个循环)。只有在荧光信号扩增期PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以在指数期的某一点上来检测PCR产物的量，并由此推断模板最初的含量。设定一定的荧光信号的域值( thresh-old)。如果检测到荧光信号超过域值，就被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数Ct(C代表循环cycle， t代表域值threshold)[3]。它与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，模板 DNA 量越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可绘制标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数[4-7]。 图1　FQ-PCR扩增图 3 实时荧光定量PCR反应方法的分类 FQ-PCR的分类方法根据其化学原理可分为探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异性结合的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或特殊设计的引物来指示扩增产物的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。目前国内外常用的荧光定量PCR技术包括SYBR荧光染料法以及荧光探针法[8]。 3.1 荧光染料 荧光染料(即双链DNA的内插染料)是一种能插入到双链DNA并发出强烈荧光的化学物质，其荧光强度的增加与双链DNA的数量呈正比[9]。目前常用的染料分子包括溴化乙锭、YO-PRO、YOYO、SYBR Green I及SYBR Gold(2002)，其中以SYBR Green I染料应用最广泛。SYBR Green I 的优点是检测方法简单，不需要设计探针，成本低，通用性好，且能够进行融解曲线分析检测扩增反应的特异性。 但其缺点是 SYBR Green I 可以与所有的双链DNA结合，因此不能进行多重PCR反应，由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。但通过优化PCR的反应条件，减少或去除非特异性产物和引物二聚体的产生，另外，也可以借助融解曲线分析产物的均一性，有助于增加定量结果的准确性。 3.2