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实验五 酶联免疫吸附试验 酶标抗体技术： 酶标抗体技术（Enzymelabelled antibody technic）是用酶标记抗体分子，进行抗 原抗体检测的技术，也叫免疫酶技术。 【原理】 酶是一种有机催化剂，酶与底物结合在有供 氢体（显色剂）存在时，出现显色反应。 酶在一定的条件下能与抗体分子结合形成酶 标抗体，这种结合既不影响酶本身的催化特 性，又不影响抗体与抗原的特异性结合，当 酶标抗体与抗原结合后，加入酶作用的底物 及供氢体，抗原存在的部位即可出现显色反 应。此种反应可用肉眼观察或用分光光度计 测出。 酶标抗体技术的用途： 酶标抗体技术可用于抗原或抗体的定 性、定量及定位检测。 反应中的酶及底物： 标记抗体的酶——辣根过氧化物酶（HRP） 底物——过氧化氢(H2O2) 供氢体——二氨基联苯胺(DAB) 邻苯二胺(OPD) 四氨基联苯氨（TMB） 【常用的酶标抗体技术】 免疫酶组化染色技术（组化法） 酶联免疫吸附试验(ELISA) （一）组化法 是用酶标抗体对标本染色,加底物和显色剂后,在显微镜下观察,抗原存在的部位出现棕黄色反应。 直接法——用酶标记抗体直接染色 间接法——用酶标记抗抗体间接染色 （二）ELISA 是在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）上进行的一种反应，显色后用肉眼或酶标仪判定反应结果。 检测方法有间接法、夹心法、双夹心法、竞争法、酶–抗酶抗体法、PPA–ELISA、BA–ELISA、斑点ELISA等多种 酶联免疫吸附试验(ELISA)的类型 间接ELISA检测猪瘟病毒抗体试验 一、用途 检测猪血清中的猪瘟病毒抗体，评 估养猪场猪瘟病毒疫苗免疫状况及 感染猪的血清学辅助诊断。 二、原理 将纯化的猪瘟病毒包被在酶标板上，加入待检血清，经37℃ 30～40min作用后，若样品中含有猪瘟病毒抗体，则与包被板上的抗原结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后，再加入酶标二抗，与检测板上的抗原抗体复合物发生特异性结合，再经洗涤除去未结合的酶标抗体，在孔中加入底物和显色剂，经酶催化底物显色，加终止液终止反应后，用酶标仪在450nm波长处测反应孔的OD值。颜色深浅与抗体含量成正比。 三、材料 1、猪瘟病毒抗原预包被板 2、被检血清 3、酶标二抗（兔抗猪IgG酶标抗体） 4、洗涤液 5、底物A液（过氧化氢 H2O2） 底物B液（四氨基联苯氨 TMB） 6、稀释液 7、终止液 2M硫酸 8、猪瘟病毒阳性血清、阴性血清 9、酶标仪 10、加样器及吸头等 酶标试剂组成： 1、包被缓冲液（0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液） 2、封闭液（1%牛血清白蛋白） 3、稀释液（0.05%吐温-20、0.01mol/L pH 7.2 PBS） 4、洗涤液（0.05%吐温-20、0.02mol/L pH7.2Tris-HCl 缓冲液） 5、底物溶液 过氧化氢（H2O2） 四氨基联苯氨（TMB） 6、终止液（2mol/L H2SO4） 四、方法与步骤 取预包被板 ↓ 待检血清100μl/孔（同时做阴、阳性及空白对照） ↓ 37℃作用30min 甩掉孔中液体，用洗液洗版3次（1min/次） ↓ 加酶标二抗（100μl/孔） ↓ 37℃作用30min 甩掉孔中液体，用洗液洗版3次（1min/次） ↓ 每孔加底物A液50 μl ，B液50 μl ，混匀 ↓ 闭光显色10min ↓ 每孔加终止液50 μl ，10min中测定结果 ↓ 酶标仪450nm处测OD值 五、结果判定 以空白对照调0，酶标仪450nm（630nm作参比波 长）测定各孔OD值。 试验成立的条件是阳性对照空OD值450nm≥0.4， 阴性对照空OD值450nm必须＜0.15。如果实验无 效，试验中的操作值得怀疑，实验应重做，并检 查材料。 样品OD值＞ 0.2+阴性对照孔均值，判为阳性； 样品OD值＜ 0.2+阴性对照孔均值，判为阴性； 如阴性对照孔均值小于0.05按0.05计算。 * *