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皮上划痕人用布氏菌活疫苗 Pishang Huahen Renyong Bushijun Huoyimiao Brucellosis Vaccine （Live）for Percutaneous Scarification 本品系用布氏菌的弱毒菌株经培养、收集菌体加入稳定剂后冻干制成。用于预防布氏菌病。 1基本要求 生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 2制造 2.1菌种 生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。 2.1.1名称及来源 采用牛布氏菌的弱毒菌株104M株。 2.1.2种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。 禁止使用通过动物传代后再分离之菌株制造疫苗。 2.1.3种子批的传代 工作种子批启开后至疫苗生产，传代应不超过3代。 2.1.4种子批菌种的检定 2.1.4.1培养特性 在含有1∶50000碱性品红培养基应生长，但在含同浓度的硫堇培养基应不生长（亦可用纸片法检查），在肝琼脂斜面培养基产生微量硫化氢。 2.1.4.2染色镜检 涂片镜检应为革兰阴性球杆菌。 2.1.4.3变异检查 用生理氯化钠溶液将新鲜培养物制成含菌2.5×109～3.0×109/ml的菌悬液，置90℃水浴中30分钟，不应出现凝集现象。用同浓度的菌悬液与1∶1000三胜黄素水溶液等量混合，于37℃放置24小时，不应出现凝集现象。用结晶紫菌落染色检查，菌落变异率不高于3%。 2.1.4.4噬菌体裂解试验 将菌种接种于肝琼脂平皿，加入布氏菌Tb噬菌体1滴，于35～37℃培养44～48小时，噬菌体流过处应无本菌生长。 2.1.4.5血清学试验 用生理氯化钠溶液将新鲜培养物制成含菌5.0×109/ml的菌悬液，与布氏菌参考血清做凝集反应，其凝集效价应达到血清原效价。 2.1.4.6残余毒力检查 用生理氯化钠溶液将35～37℃培养44～48小时之肝琼脂斜面新鲜培养物制成菌悬液，并稀释成含菌1.5×109/ml、3.0×109/ml、6.0×109/ml、1.2×1010/ml和2.4×1010/ml等5个浓度的菌悬液。取体重18～20g小鼠25只分为5组，各组分别用不同浓度的菌悬液腹腔注射，每只0.5ml，观察7天，计算LD50，应含菌1.0×109～6.0×109。 2.1.4.7免疫力试验 每3～5年至少做一次免疫力试验。用生理氯化钠溶液将菌种第1代新鲜培养物制成2.0×108/ml的菌悬液。取体重300～350g豚鼠10只，每只皮下注射1ml，经25～30天后，每只豚鼠皮下攻击羊型强毒布氏菌10个或20个感染量（MID）。同时取3只豚鼠作对照，皮下注射1MID。免疫及对照豚鼠于注射毒菌悬液后均观察25～30天后解剖，取出鼠腹股沟淋巴结、腹主动脉旁淋巴结、肝及脾，分别接种肝琼脂中管斜面培养基，于35～37℃培养10天。如免疫动物组织之培养物有布氏菌生长，应用硫堇培养基（亦可用纸片法）和硫化氢反应做菌型鉴别试验。对照组3只豚鼠都必须发生全身感染，即肝脏或脾脏应分离出羊型毒菌。免疫组攻击10MID时，10只豚鼠中不应有2只以上分离出羊型毒菌；攻击20MID时，10只豚鼠中不应有3只以上分离出羊型毒菌。 2.1.5种子批的保存 种子批应冻干保存于8℃以下。 2.2原液 2.2.1生产用种子 2.2.1.1将工作种子批菌种启开后，接种在肝琼脂斜面或其他适宜培养基上，置35～37℃培养44～48小时为第1代。第1代菌种须进行1∶500三胜黄素玻片凝集试验，只有光滑型菌方可用于疫苗生产。第1代菌种斜面于2～8℃可保存15日。 2.2.1.2将菌种接种到肝琼脂或其他适宜培养基上，置35～37℃培养44～48小时，培养物经肉眼纯菌检查合格后，弃去凝固水，用无菌生理氯化钠溶液制成菌悬液。由此制备适宜数量的生产用种子。 2.2.2培养基 采用pH6.6～7.2的琼脂或经批准的其他培养基。 2.2.3菌种接种和培养 将第2代或第3代生产用种子接种2.2.2项培养基上，置35～37℃培养44～48小时，肉眼逐瓶检查，有杂菌者应废弃。 2.2.4采集 用含有蔗糖、明胶、硫脲和味精的稳定剂或其他适宜的稳定剂洗下菌苔或刮取菌苔于稳定剂内。数瓶培养物可采入或刮入1瓶（或1大管）稳定液内，即为原液，置2～8℃保存。 2.2.5原液检定 按3.1项进行。 2.3半成品 2.3.1配制 将合并后的原液稀释成每1 ml含菌1.9×1011。稀释后的原液经纯菌检查合格后即可分装冻干。由原液采集到冻干不得超过7天。 2.3.2半成品检定 按3.2项进行。 2.4成品 2.4.1分批 应符合“生物制品分批规程”规定。 2.4.2分装与冻干 应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。分装后应立即进行冻干，真空封