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皮上划痕用鼠疫活疫苗 Pishang Huahenyong Shuyi Huoyimiao Plague Vaccine （Live） for Percutaneous Scarification 本品系用鼠疫杆菌的弱毒菌株经培养后收集菌体，加入稳定剂冻干制成。用于预防鼠疫。 1基本要求 生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 2制造 2.1菌种 生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。 2.1.1名称及来源 采用鼠疫杆菌弱毒菌株EV株。 2.1.2种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。 2.1.3种子批的传代 工作种子批菌种启开至疫苗生产，传代应不超过3代。 2.1.4种子批菌种的检定 2.1.4.1培养特性 在琼脂平皿上，35～37℃培养44～48小时之菌落应为粗糙型，在肉汤培养基的液面有薄菌膜，管底有沉淀物，肉汤透明。 2.1.4.2染色镜检 涂片染色镜检，为革兰阴性杆菌。 2.1.4.3生化反应 发酵葡萄糖，产酸不产气；石蕊牛乳轻度变红；在甘油培养基内不产酸不产气（附录ⅩⅣ ）。 2.1.4.4噬菌体裂解试验 将EV菌种涂于琼脂平皿上，加入稀释度为10-6以上的鼠疫噬菌体1滴，于28℃培养44～48小时，噬菌体流过处应无本菌生长。 2.1.4.5特异性毒性试验 选用体重300～400g豚鼠3只，每只皮下注射含菌1.2×1010（于28～30℃培养44～48小时）的培养物。在注射后第6天解剖1只，第21天解剖2只。肉眼检查注射部位、脾、肝和肺，并用脾、肝、肺及心血进行培养，其中心血和肺经培养应无本菌生长。肉眼检查病变，注射部位可见充血，浸润变为脓疡，肝和脾可有丘疹状结节，肺部不应有鼠疫特异病变为合格。肺部如有显著病变时，应用同数量豚鼠复试，若仍有显著病变时，菌种应废弃。 2.1.4.6免疫力试验 选用体重200～250g的豚鼠10只，每只皮下注射含菌7.0×105（于28～30℃培养44～48小时）的培养物，于20～25天后进行攻击，每只皮下感染鼠疫强毒菌200MLD。同时用3组豚鼠作对照，每组3只，各组豚鼠分别皮下注射0.5MLD、1MLD及2MLD的毒菌。免疫组及对照组至少观察25天。免疫动物存活不少于8只；而对照动物注射0.5MLD部分死亡，注射1MLD或2MLD全部死亡时，免疫力试验为合格。 2.1.5种子批保存 种子批应冻干保存于8℃以下。 2.2原液 2.2.1生产用种子 2.2.1.1第1代菌种 将工作种子批菌种启开后，接种于厚金格尔琼脂培养基上，于28～30℃培养44～48小时为第1代，置2～8℃保存可使用15天。 2.2.1.2第2代菌种 用生理氯化钠溶液将第1代菌种洗下，接种足够量的种子瓶，于28～30℃培养44～48小时为第2代，培养物经肉眼纯菌检查合格后，弃去凝固水，用无菌生理氯化钠溶液制成菌悬液。由此制备适宜数量的生产用种子。 2.2.1.3第3代菌种 在第2代菌种不够的情况下，用生理氯化钠溶液将第2代菌种洗下，接种足够量的种子瓶，于28～30℃培养44～48小时为第3代，培养物经肉眼纯菌检查合格后，弃去凝固水，用无菌生理氯化钠溶液制成菌悬液。由此制备适宜数量的生产用种子。 2.2.2生产用培养基 采用厚金格尔琼脂培养基（pH6.8～7.2）或经批准的其他培养基。 2.2.3菌种接种和培养 将第2代或第3代生产用种子接种2.2.2项培养基上，于28～30℃培养44～48小时后，逐瓶肉眼检查，有杂菌者废弃。 2.2.4采集合并 用由蔗糖、明胶、硫脲、味精及尿素组成的稳定剂洗下菌苔（洗菌前弃去凝固水）或将菌苔刮入上述稳定剂内，进行纯菌试验，合格后方可合并制成原液。 2.2.5原液检定 按3.1项进行。 2.3半成品 2.3.1配制 根据3.1.2项测定的原液浓度，用稳定剂稀释至每1 ml含菌1.6×1010。 2.3.2半成品检定 按3.2项进行。 2.4成品 2.4.1分批 应符合“生物制品分批规程”规定。 2.4.2分装与冻干 应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。分装后应立即冻干，可真空封口，亦可充氮封口。 2.4.3规格 按标示量复溶后每瓶0.5ml（10次人用剂量），含菌8.0×109；按标示量复溶后每瓶1.0ml（ 20次人用剂量），含菌1.6×1010。每1次人用剂量含活菌数应不低于2.0×108。 2.4.4包装 应符合“生物制品包装规程”规定。 3检定 3.1原液检定 3.1.1纯菌检查 按附录Ⅻ A方法做纯菌检查，生长物做涂片镜检，应符合鼠疫EV菌株特征，不得有杂菌。 3.1.2浓度测定 用国家药品检定机构分发的浓度测定用参考品，以分光光度法或其它方法测定浓度。 3.2半成品检定 纯菌检