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Affymetrix 表达谱芯片实验 培训手册 2006年7月 目录 总RNA的提取和纯化 提取总RNA 总RNA的定量和质检 纯化总RNA 纯化总RNA的定量和质检 CDNA的合成和纯化 1stcDNA的合成 2ndcDNA的合成 纯化双链cDNA IVT合成cRNA和cRNA的纯化 IVT合成cRNA 纯化cRNA cRNA的定量和质检 cRNA片段化、配制杂交液 片段化cRNA 片段化cRNA的质控 配制杂交液 芯片杂交 预杂交芯片 杂交液的准备 杂交芯片 洗脱芯片 扫描芯片 总RNA的提取和纯化 提取总RNA（要求最低1－8 ug） 提取（用Invitrogen的TRIzol提取） 如果是TRIzol 保存的细胞直接进行II步；如果是组织，在液氮中研磨成粉末。 待液氮挥发干，立即加入TRIzol，每100mg组织加1ml TRIzol，融化后，用加样枪反复吸吹，使样品充分裂解，移入1.5ml离心管中，室温静置3～5分钟。 在离心管中每1mlTRIzol起始量加200ul氯仿，振荡混匀。 将离心管在4℃,12000rcf，离心15分钟。 用移液器小心吸出上层水相，加入另一离心管中，每ml TRIzol起始量加入500ul异丙醇。 －20℃,沉淀35 min以上。 4℃,12000rcf，离心10分钟。 小心移出上清。 沉淀中加入1mL 75%乙醇，4℃,12000rcf，离心10分钟。 重复用75%乙醇洗涤一次RNA沉淀。 去上清，稍微晾干，RNA略显透明，加入适当体积（30 ul）的RNase-free的水，充分溶解。 定量和检测总RNA 紫外定量和检测 用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，1OD=40ug/ml。 根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度,纯RNA的OD260/OD280比值应接近2.0(比值最好在1.9～2.1之间)。 变性胶电泳质检 配制1.2% 的电泳胶 10× MOPS Gel Buffer 10ml Agrose 1.2g RNase-Free Water 90ml 加热溶解Agrose，稍微冷却，加入 37%甲醛 1.8ml EB(10mg/ml) 1ul 摇匀后倒胶，待胶冷凝后，置于电泳槽中，浸于1× MOPS Gel Buffer中平衡10分钟，待用。 样品变性 5×Loading Buffer 2ul RNA样品 1ug RNase-Free water 调节至10ul 在65℃，变性5分钟，立即置于冰上冷却。 电泳 将处理好的RNA样品，稍微离0心， 70V恒压电泳1小时。在凝胶成像仪上观察结果。 C）生物分析仪分析RNA完整性 纯化总RNA QIAGEN的RNeasy Mini Kit（总RNA量大于45 ug）或Micro Kit（总RNA量小于45 ug）。 RNeasy Mini Kit 将总RNA的体积用RNase-free的水调整到100ul，(因QIAGEN纯化柱的最大上样量为100ugRNA，所以一般取RNA不大于100ug)。 加入350ul RLT工作液(1ml RLT 中加10ul beta-ME，混匀而成)，充分混匀。 加入250ul 无水乙醇，充分混匀(不要离心)。 将混好的700ul样品加到QIAGEN纯化柱中，8000rcf，离心15秒。 弃滤液，加入500ul RPE工作液(一份RPE加入4份无水乙醇混匀而成)，8000rcf，离心15秒。 弃滤液，加入500ul RPE工作液(一份RPE加入4份无水乙醇混匀而成)，8000rcf，离心2分钟。 将纯化柱放入一个新的收集管，最大转速，离心1分钟。 将纯化柱换入一个EP管中，在纯化柱膜中间加30ul RNase-free的水，室温放置1分钟，最大转速，离心1分钟。 将EP管中的样品移入一个新的EP管中。 RNeasy Micro Kit 将总RNA的体积用RNase-free的水调整到100ul。 加入350ul RLT工作液(1ml RLT 中加10ul 2-ME，混匀而成)，充分混匀。 加入250ul 无水乙醇，充分混匀(不要离心)。 将混好的700ul样品加到QIAGEN纯化柱中，＝8000rcf，