HPLC原理和应用方案.ppt

第一节 概述 高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）是20世纪60年代末发展起来的一种新型微量分离分析技术。 高效液相色谱法是在经典液相色谱的基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。 一、HPLC与经典LC区别 主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段 二、HPLC与气相色谱（GC）的区别 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别 流动相的差别 2．流动相差别 三、高效液相色谱仪流程图 第二节 高效液相色谱仪器 高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 储液器 梯度混合器 进样器 超滤器 自动收集器 B、停流式进样器 D、自动式进样器优点：耐高压、加样准确、重现性好、可连续进样、适于较大体积的样液。 一支层析柱的指标包括柱的形状、结构、层析介质和填充技术等，统称为层析柱技术（column technology）。 SEM IMAGE OF MONIDISPERSE Si PARTICLES 按照层析柱型号分 按照层析柱填料分 4、检测系统 二、辅助部分 3、梯度混合器：泵前混合（先混合再进高压泵，操作简单，易产生气泡）泵后混合（不易产生气泡，操作复杂） 4、自动收集器 第三节 高效液相色谱的分类 液-固吸附色谱 液-液分配色谱 离子交换色谱 排阻色谱 亲和色谱 反相高效液相色谱 一、液-固吸附色谱liquid-solid adsorption chromatography 二、液-液分配色谱liquid- liquid partition chromatography 三、离子交换色谱ion-exchange chromatography 四、排阻色谱size- exclusion chromatography 五、亲和色谱 Affinity chromatography 六、反相高效液相色谱 根据溶质的性质，采用极性的流动相和非极性的固定相的分离体系，利用固定相非极性基团的疏水效应而建立的一种分离模式。 第四节 高效液相色谱实验技术 二、流动相 2. 流动相类别 3. 流动相选择 4. 选择流动相时应注意的几个问题 三、进样 【柱的使用和维护】 第六节 高效液相色谱的应用 采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重现性。 两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多种洗脱曲线：线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯形梯度。线性梯度最常用，尤其适合于在反相柱上进行梯度洗脱。 在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视： ①要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。 有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围后就不互溶，使用时更要引起注意。 当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。 【注意事项】 ②梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。 进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。 用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时产生气泡。 2、脱气装置 常压下配制的溶液中会溶解少量气体分子，在高压下集结产生气泡，洗脱时产生脉冲，影响柱压稳定性。 真空脱气：在负压下将气体分子抽出来，适宜于水溶液； 超声波脱气：利用超声波与溶剂分子产生共振使气体分子释放出来，适宜于有机溶剂与水溶液。 固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂； 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上。 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保