生化大实验实验步骤讲解.docVIP

实验一、碱裂解法提取质粒DNA及检测 实验目的与原理简介 质粒DNA的提取是基因工程操作中常用的基本技术。质粒作为载体应具备下列四个特点：①有足够的容纳目的基因的幅度，并且对于携带的目的基因能够借助载体的复制和调控系统得到忠实的复制与增殖。②在非必要的DNA克隆区有多种限制性核酸内切酶的单一识别位点，易于基因片段与载体的连接、重组与筛选。③与宿主细胞有天与一个或多个遗传表型（如抗药性、营养缺陷型或显色表型反应等）。④拷贝数多，易于宿主细胞的DNA分开，便于分离提纯。 分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细胞使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。 碱裂解法质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的。在强碱性pH时，染色体线性DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，调节pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性纠缠形成网状结构，经过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一直沉淀下来而被除去。 提取基因工程中运载基因的载体，掌握最常用的提取质粒DNA的方法。 二．实验试剂 1，SolⅠ100ml： 1M Tris-HCL（pH8.0）2.5ml，0.5M EDTA 2ml, DDW 91ml, 20%葡萄糖4.5ml( 葡萄糖单独灭，灭完后加进Sol I)，高压灭菌，4°保存。 2，SolⅡ100ml：（新鲜配制，常温使用）10% SDS 50ml， 2M NaOH 50ml。使用前将两种溶液混合。 3，SolⅢ 500ml：KAc 147g， HAc57.5ml，加300mlDDW搅拌，定容至500ml。高压灭菌，4°保存。 4，TE 100ml：1M Tris-HCl（pH8.0）1ml， 0.5 M EDTA 0.2 ml, 加DDW 至100ml。高压灭菌！ 5，70%乙醇 6，苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。按1/100的比例接种保存的pPIC9K大肠杆菌克隆菌种到3 mL的含有适当抗生素LB培养基，37、180rpm培养过夜或培养12小时以上，活化菌种(至对数生长期)。将活化的菌种按1/100接种至200 ml的LB培养基，37、250rpm剧烈震荡培养过夜。 离心管（0mL）分装菌，离心去上清（10000rpm，5min，4）；弃上清，将离心管倒置于卫生纸上几分钟，使液体尽可能流尽。重悬于μl 冰冷的Sol中；剧烈震荡重悬菌体。 加入mL SolⅡ轻轻颠倒数次（动作要轻柔，防止断裂DNA形成碎片），彻底混匀，室温放置10min（SolⅡ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。 加入mL冰冷的 Sol立即轻轻颠倒完全彻底混匀，冰上放置10min。 4℃，1000rpm离心10min。Sol为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。 收集上清至新的离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀,沉淀，室温放置大于10min。1000rpm离心min，小心移出上清于一新离心管中7、加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置 2-5min，离心1000rmp×10min。8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml 7％乙醇洗沉淀一次，1000rmp离心5 min。9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥。10、将沉淀溶于0μl DDW中，储于-20℃冰箱中。oC 5min 35个循环： 94 oC 1min,63 oC 1min, 72 oC 1min； 延伸： 72 oC 10min 注：聚合反应时间是根据靶基因的长度按每分钟聚合1000bp的速率来计算出来的。 抽取每种扩增样品5-10μl，用琼脂糖电泳来分析扩增结果， 用DNA marker 来判断扩增片段的大小 。凝胶一般用Goldview染色后观察扩增的量与片段大小。 从阳性对照样品的相对分子量的目的条带的亮度与粗细可以判断PCR扩增的效率；阴性对照样品在目的条带附近应该没有相应条带。 对可能发生PCR过程中主要疑难问题的解析 问题 可能原因 解决方法 无产物或产量低 模板浓度偏低或偏高 电泳检测模板浓度，调整模板用量 模板降解 重新制备；基因组DNA、cDNA应小量分装后低温保存 模板中含有抑制反应的杂质 纯化模板 引物浓度不足 调整引物浓度，特别是针对长片段PCR 引物存在二级结构 重新设计引物，避免二级结