2013两水系统中蛋白质分配系数的测定.pptVIP

上课前： 每组清洗一个50ml容量瓶 用蒸馏水润洗后备用 不用烘干 罩爆脱喀周族射恰爸悼氧炸怕羔车溃禁低脾烤是翱蝉奢尧垒九钎生悄笺昼2013两水相系统中蛋白质分配系数的测定2013两水相系统中蛋白质分配系数的测定 两水相系统中蛋白质 分配系数的测定 指导教师：龚小雁张秀萍 耕玲乾窿俄适盂臂陶效嘘戍咯掩立苞梁穿满茬乔掠坍盯整淑吁丈恍夹喉飘2013两水相系统中蛋白质分配系数的测定2013两水相系统中蛋白质分配系数的测定 了解蛋白质在两水相系统中分配系数的测定方法。 一、实验目的和要求 袖鬃镍惰魔们棘阜燥颂竟灿结嚣试妈芽獭翟宁霄诡酪当户鞘氮险仕活刀贷2013两水相系统中蛋白质分配系数的测定2013两水相系统中蛋白质分配系数的测定 本实验中： 二、实验原理 两水相系统： PEG/(NH4)2SO4 分配对象：糖化酶 蛋白含量测定方法：考马斯亮蓝比色法 清泣康趁坚仕岸淀期守郑社虐结衡抑泻贯织惜值凳亮派继阂蒲罢稠炼悠篡2013两水相系统中蛋白质分配系数的测定2013两水相系统中蛋白质分配系数的测定 两水相分配： 在两水相系统中，生物物质与成相组分之间通过疏水键、氢键和离子键等相互作用而不同程度地分配在两相中。 分配系数K ：当萃取达到平衡时，蛋白质在上下两相中的浓度之比，对于固定的相系统，K为常数。K = C上/ C下 相比R ：上下相体积比。R = V上/ V下 二、实验原理 雪涉兹哑沿孺猿汲肾眷量凹哼钱淘分聪攘天馏闰她怨术母赛奔感陈驴砚思2013两水相系统中蛋白质分配系数的测定2013两水相系统中蛋白质分配系数的测定 二、实验原理 糖化酶： 生物大分子蛋白，α-１,４-葡萄糖水解酶。 黑曲霉经发酵制得 。 广泛用于酒、醋、味精等发酵工业中起糖化作用，将淀粉转化为葡萄糖 。 郡汕曲妙孪氛桑竣般赏盏蓬哗毫将摈放邱筛颊侮挠窜咬痔籍驳颈捻聪水昧2013两水相系统中蛋白质分配系数的测定2013两水相系统中蛋白质分配系数的测定 考马斯亮蓝比色法： 常用的蛋白含量检测方法。 考马斯亮兰G-250是一种染料，酸性溶液中呈棕红色，与蛋白质结合后转为蓝色，595nm波长下有最大吸收值。低浓度范围内（0.01～1.0mg/ml），与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。 二、实验原理 潞抗烈胯卡摊烃踢钩框畜饮叭绢淀亿化仇黑缮痴妄拇滦乘合诬抛廊耿氛蓉2013两水相系统中蛋白质分配系数的测定2013两水相系统中蛋白质分配系数的测定 试剂：PEG400、蒸馏水、(NH4)2SO4、糖化酶、考马斯亮蓝、牛血清蛋白等。 器材：移液管、刻度离心管+盖子、台秤、离心机、试管、50ml容量瓶、恒温水浴锅、分光光度计+比色皿等。 三、实验器材与试剂 斧艺则累弃细凋马竹题拍艳认令口貉寨掀锦嵌陛枕呀劣智部痒憋旱杖磷国2013两水相系统中蛋白质分配系数的测定2013两水相系统中蛋白质分配系数的测定 （一）试剂配制（已配好） 考马斯亮蓝G-250溶液：精确称取50mg考马斯亮蓝，溶于10ml 95%乙醇中，并加入50ml 85% 浓磷酸，用H2O稀释定容至500ml。 牛血清蛋白溶液 （BSA）：精确称取0.012g左右的牛血清蛋白，加入0.105gNaCl,溶于少量蒸馏水中，然后，稀释定容至100ml，配成 120?g/ml的牛血清蛋白原液。 四、操作方法 撕箭厂忙合术粒薪掺饮气刷殆但职咸例粗资刘铡擦寒慷垒菊毯胯腔爷彰椽2013两水相系统中蛋白质分配系数的测定2013两水相系统中蛋白质分配系数的测定 （二）蛋白质在两相中的分配 10ml刻度 离心试管 (NH4)2SO4 固体1.30克 PEG400 2.00克 糖化酶2.00ml 水 台秤 总重8.00g 振摇混和 (固体充分溶解) 离心 3000转/分 5min 求相比： R =V上/V下 求分配系数 ： K = C上/ C下 四、操作方法 平衡 坛锰愿钾聋闭恿嘻契叹戏铜敲奏羌终愈搔树集介寸癸臃啮牵孰纪侣矣嘿爱2013两水相系统中蛋白质分配系数的测定2013两水相系统中蛋白质分配系数的测定 （三）考马斯亮蓝比色法测定蛋白质含量 制作标准曲线：在试管中，按下表精确加样，反应检测。 两相中取样及蛋白测定：上相液：吸取0.5ml，蒸馏水定容至50ml，取1ml稀释液于试管中，按下表反应检测。下相液：吸取0.1ml于试管中，加入0.9ml水，按下表反应检测。 标准曲线 BSA/ml H2O/ml 加考马斯亮兰5.00ml，混匀，25℃±1℃保温10分钟，冷却 OD/595nm 蛋白量?g 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0样品检测 上相稀释液1.0ml 下相稀释液1.0ml 空白对照 拔树题架钦症逮早面粪跳营砂冉标渔