2.2_Ecoli_Vector解读.pptVIP

SacB基因:编码一种将蔗糖转化为果聚糖的酶，当含该基因的细胞培养在2%以上蔗糖培养基中时,果聚糖积累在细胞周质空间内,导致大肠杆菌细胞死亡. SacB基因被克隆到原Tetr 基因的BamHI- SalI间,在其上游加上E.coli基因启动子,克隆位点BamHI位于这两个DNA片段间,外源DNA片段插入时可进行显性筛选重组子 为了使sacB基因自发突变减小到最小限度,sacB基因上游还有一个P1 C1阻遏物结合位点与其启动子重叠.凡是表达P1 C1基因的细胞,sacB基因表达受阻,在无蔗糖条件下,这种细胞会生长得更好 iii. 克隆策略 3.3 kb短臂：含pac,loxP, 无启动子的sacB 26 kb长臂: 含P1裂解复制子,Kanr,P1质粒复制子,loxP 位点. * 包装: 重组DNA分子先用pacase或抽提物Ⅰ酶切pac位点,然后用抽提物Ⅱ(含头部和尾部)进行包装直至头部充满DNA,最后与尾部相连成有感染力的重组P1噬菌体颗粒. iV.??重组DNA分子形成 当重组DNA分子进入宿主细胞后,特异性位点重组发生在两个方向相同的loxP位点, 该过程由宿主细胞表达的重组酶(Cre)催化. v. 宿主菌 E.coli