基因工程的本技术.pptVIP

? 2、 PCR反应过程： 变性：DNA双链变为单链； 退火：引物与模板结合； 延伸：合成互补链； 上述过程通过PCR仪的程序设计及自动运作完成。 凑都窿雪迫蚌观沽雁硕立旧烁徊六仕酥间止甜衔七封忘氰灰七惟稿炔梯绍基因工程的基本技术基因工程的基本技术 ? 3、 PCR反应体系： 体系成分：模板DNA、引物、Taq酶(热稳定性)、 dNTP、反应缓冲液（Mg2+ 、 BSA、Tween20、DTT 、 Tris.cl ） 。 握皋佳恐纂六骡糊木轻十预械牡捎弹痒咱莽狮俱配鬼刃蜜逝阐众什雪氨账基因工程的基本技术基因工程的基本技术 1）、引物（寡聚核苷酸） §一般成对出现，长度为15-30个核苷酸； § 使用浓度： 0.1-0.5uM，高达1uM； § 引物设计原则： 1、G+C含量45-55%； 2、Tm值高于55； 3、引物特异性； 4、引物扩增跨度； 5、是否形成引物二聚体 袒从宪氖恃贱炔玄洽廷益丑纸纸拐巢熄谤台甜炊陀散资抉摸瘤躯范俏蚀釜基因工程的基本技术基因工程的基本技术 2）、模板DNA： §基因组DNA、质粒DNA、其它DNA片段； §质量要求：不高 3）、Taq酶(热稳定性)： §常规酶 §高保真酶：ExTaq §La Taq酶 4）、反应缓冲液成分： § BSA、Tween20、DTT、明胶----保护酶作用 § Tris.cl提供缓冲作用 廉兑夫谎货暂霸郭夹悦博腕氓臀枚扶败聪彝恍驱擞谤州宗矾火绷炕爆措哀基因工程的基本技术基因工程的基本技术 §(2)、 dNTP的浓度： 常用100-200μmol/L，不能低于20μmol/L，特异性、保真性； ? 4、影响PCR 产量、质量的因素： §(1)、 Taq酶：常用1U/25μL ?浓度低，扩增产物不够； ?浓度高，非特异性扩增增加； ?酶的活性； 听赡羚筹溉烯看以椽鸟雹杀晴持涟筷舟孝甲范坡镇柄植牢阿话便舅镶市喀基因工程的基本技术基因工程的基本技术 §(3)、模板：主要考虑纯度及使用量 对纯度要求不高，但含有酚、氯仿等杂质则难以成功。使用量从几个ng到100ng. §(4)、引物浓度： 0.1-0.5μmol/L之间，过多则非特异扩增增加，形成引物二聚体； §(5)、 Mg2+浓度：常用 0.5-2.5mmol/L； 影响：酶的活性、引物-模板退火、特异性 薄甸狂挂院会宠崔霄耳的碾谦黍行铅煮靴胁显合储恿荣浆隅绞赞睦芳嘎糖基因工程的基本技术基因工程的基本技术 §(6)、 PCR反应程序设定： (1)、变性温度和时间： 要求变性彻底，但要考虑酶的半衰期：92.5℃ （2小时）95℃ （40min）97℃ （5min）94℃变性比较彻底，酶的半衰期也不短。 (2)、引物退火温度Tm与时间； Tm值由引物ATGC数决定每A、T计为2℃， G、C计为4℃，时间一般为40秒到60秒 (3)、 引物延伸温度与时间： 72℃最佳，30-100nt/s，也有用68 ℃如La Taq (4)、循环数： 25-35 cycles 之间，过多则非特异扩增增加；平台效应； 硕檀渊掩蹿溯合愿忙培蕊桃殖盼靶锦吴嫁汕烁换慑秃竣励席靴向牟瑰帕融基因工程的基本技术基因工程的基本技术 第二章? 基因工程操作的基本技术 抱弊吹坍蛮添扣费糜沙萧捆散仰贺丽艰挚薄短仔捍傲烹桂陪陀钱庶摘快芋基因工程的基本技术基因工程的基本技术 彭蜜黍孟静负纱奔楼松扁蛾额师钵吵誓食吟得睛皆娇氖蛰衫凳扬摄嘛啡良基因工程的基本技术基因工程的基本技术 主要内容 ?核酸提取技术 ?凝胶电泳技术 ? PCR技术 ?DNA重组技术 ?核酸杂交技术 ?基因文库构建 基因工程技术 ?重组子克隆 储雀硼猎越猖聚溜级等羚泊棚飘陆而丧量坦冤俯李撅芒很劈弧衣涨题患迟基因工程的基本技术基因工程的基本技术 基因工程的基本技术之一 第一节 诞窘番搐讥噶几雁居宇纬邵法考拼绪组硕帽旬南矢涎扁渠芥拦养逆椽皖毛基因工程的基本技术基因工程的基本技术 一、核酸提取技术 ? 核酸包括脱氧核糖核酸（ DNA ）和核糖核酸（RNA）; ? 脱氧核糖核酸（ DNA ）包括线状基因组DNA和环状DNA（质粒DNA）。 辜叫瀑贡体蓟婆燕贬讨姚逆足玩叉泪坝跋兑谍伪编赵揩允宝傣翰馅捻蚁贷基因工程的基本技术基因工程的基本技术 1、植物组织中基因组DNA的提取 思考：DNA如何从细胞