2005-分子克隆技术--精品课程..ppt

从低严谨度到高严谨度冼膜液（具体情况而定）1×SSC/0.1%SDS洗膜两次（冷5min，热65℃，15min）?检测信号强度 ?0.5×SSC/0.1%SDS 热冼 65℃, 15min ?依情况可有改动0.2×SSC/0.1%SDS or 0.1×SSC/0.1%SDS。SSC调整[Na+]，缓冲容量大，改变Tm，从而洗掉非特异性探针杂交体，0.1%SDS可以洗去膜上的封存剂。 3．洗膜 4．包膜 膜从洗膜液中捞出，在滤纸上凉干，膜表面无可见水膜为止（忌太干，以防探针难以洗脱，影响再次使用）用保鲜膜包膜，压片，-20℃或-70℃，依据信号强弱曝光（3—7天） 5．冲洗X-光片 在暗室红灯下取出X-光片，置入显影液中至杂交带显现出来（显影时间依据信号强弱及曝光时间长短可由几秒钟到2分钟），转入清水中漂洗，然后放入定影液中定影至清亮（约10分钟）。自来水冲洗干净后，晾干，读片. 显影液配方： 成分 相纸 胶卷 X-光片 温水（40℃左右） 750ml 750ml 750ml 米吐尔 3.1g 1g 4g 无水亚硫酸钠 45g 75g 60g 对苯二芬 12g 9g 10g 无水碳酸钠 67.5g 25g 40g 溴化钾 1.9g 5g 4g 加水定容至 1000ml 1000ml 1000ml再次使用膜前，必须洗去上次探针！ (1) 0.1%SDS，0.1×SSC10min (2) 0.1NaOH，0.2%SDS2-3min (3) 0.2M Tris.HCL， 0.2%SDS，0.1×SSC 20min 只洗去探针，而不影响膜上的靶DNA（因为DNA与膜是共价键结合，而DNA与探针的结合是氢键结合）。? 6．膜上探针洗脱杂交效果改良应考虑问题(一）： 保证转膜质量； 操作规范； 提高灵敏度（杂交） （信号强度）； 探针量及标记量（探针变性）； 比活（性）度 =108dpm/u(108弱)； 靶DNA量（绝对量，酶切转膜决定；相对量，靶DNA相对于探针过量时，完全配对杂交，探针过剩时，完全配对和非严格的完全配对均有发生）； 有惰性聚合物增加灵敏度；10%(w/v)500,000(mw)dextran sulfate或8%(w/v)PEG6000. (对于单链探针，可以增加10-fold杂交信号，dsDNA成100-fold地增加杂交信号)? 杂交效果改良应考虑问题（二） 4. 提高特异性 高盐溶液促进探针与靶序列的碱基配对 20×SSC 3M NaCl/0.3M Na3Ci 杂交后洗膜温度T?Tm 杂交后洗膜液浓度组成，高严谨度洗膜液使不完全配对的杂交失去稳定，致使探针脱落 杂交时间8hrs 以后，DNA探针逐渐退火，少量自由与靶DNA杂交. 探针长度（1000bp）过长，高严谨度下难洗脱非完全配对杂交探针。 Troubles shooting guide for DNA Blotting and Hybridization Analysis（一） 信号弱(poor signal) 的可能原因： probe specific activity too low (108dpm/ug) Inadequate depurination (transfer of DNA is poor) Not enough target DNA (DNA固定效果差) Transfer time too short Probe concentration too low Incomplete denaturation of probe Incomplete denaturation of target DNA Final wash was too stringent Hybridization time too short Membranes adhered during hybridization or washing (not too many membramesat once) Bubbles in a hybridization ba Not enough wash solution Agarose dried on the membrane（ 斑点） Hybridization temperature too low Labeled probe molecules are too short (nick-translation labeling, reduce amount of DNasel) Probe concentration too high Inadequate prehybridization =3hrs Not enough SDS in wash solution 封