生物化学笔记(王镜岩)课题.doc

讲一 生物大分子：糖、脂、蛋白质（酶）、核酸、维生素、激素 生物化学之父：费舍尔 讲二 地球上数量最多的一类有机化合物：糖类 α和β吡喃葡萄糖（羟基在下为α型，在上为β型） 糖原高度分支的生理意义： 第三章、蛋白质 20种氨基酸 英文名 等电点 掌握氨基酸的用途、现象 DNFB法 PITC Cys半胱氨酸 Ellman反应，DTNB，二硫硝基苯甲酸 Ellman反应（二硫硝基苯甲酸，DTNB） Cys与二硫硝基苯甲酸 (DTNB) 或称 Ellman 试剂发生硫醇-二硫化物交换反应。 反应中 1 分子的Cys引起1分子的硫硝基苯甲酸的释放。它在 pH 8.0 时, 在 412nm 波长处有强烈的光吸收, 因此可利用分光光度法定量测定-SH。 肽平面（酰胺平面） —— 由肽键周围的6个原子组成的刚性平面 3.6蛋白质的纯化 注：用尽可能少的步骤、尽可能短的时间。 前处理阶段 物理法——冻融法，超声波法，均浆法，研磨法等。 酶裂解法——就是利用水解酶将细胞壁和细胞膜消化的方法，常用的水解酶有溶菌酶、葡聚糖酶、蛋白酶、糖苷酶、壳多糖酶、细胞壁溶解酶等。其中溶菌酶主要对细菌类有作用，其他酶对酵母作用显著。 粗分级/粗分离 根据蛋白质的①溶解性质、②大小不同、③带电状态不同/电荷多少 ④净化方法根据与其他化合物相互作用的蛋白质（部分蛋白质对..有特定的..） ②：凝胶过滤层析 常用凝胶过滤介质 Sephadex：交联葡聚糖，是采用环氧氯丙烷作交联剂将右旋葡聚糖交联而成。干粉容易膨胀，在水、盐溶液、有机溶液、碱和弱酸中化学性质稳定，可高压灭菌。高交联度的Sephadex，其颗粒坚硬，适于高流速下操作。 Sephacryl : 烯丙基葡聚糖同N、Nˊ—甲叉双丙烯酰胺共价交联而成。颗粒坚硬，性质比Sephadex更为稳定，可高压灭菌，在pH3~11条件下稳定，可用有机溶剂洗脱，也可用SDS、尿素及盐酸胍洗脱。 Sepharose：琼脂糖凝胶，是将琼脂糖溶液冷却，多糖链形成双螺旋，凝集成束，自发的形成稳定的珠状颗粒。琼脂糖由氢键维系，在pH4~9条件下稳定，超过40℃熔化，冷冻出现珠状。 可分为Sepharose 2B、4B、6B（即含琼脂2%、4%、6%）。 Sepharose CL 又称交联琼脂糖，是Sepharose 同 2，3-二溴丙醇在强碱下交联而成。在pH3~11条件下稳定。 Sepharose Fast Flow 是经过高度交联的琼脂糖珠体，大大增加了其机械强度，以流速快为特征。由于流速快，所以工业规模使用。有极高的物理化学稳定性，可用多种有机溶剂清洗，还可用1-2mol/L的NaOH进行“原位清洗”。 一些注意事项 为了提高分辨率，柱高应为柱直径的20～40倍； 上样量应小于柱床体积的5%，最大不应超过柱床体积的10%，上样的蛋白质样品浓度以不超过4%为宜，浑浊样品需离心后上样。 洗脱时，流速要恒定。缓冲液的pH值、离子强度等必须都有利于蛋白质稳定；中等离子强度的缓冲液有助于消除蛋白质与凝胶可能产生的相互作用； Sephadex在使用前需要溶胀，一份凝胶加10份水；在摇床上或手动混合，避免使用电力搅拌器；待凝胶颗粒沉降后，去除上清，重复几次，直到液相不再混浊为止；自然溶胀需24h或几天，加热可促进溶胀，1～2h即可完成； ③：离子交换层析 离子交换层析类型 强酸型：磺乙基、磺丙基 阳离子交换树脂 中酸型：磷酸基 弱酸型：羧甲基 强碱型：三乙基氨基乙基、 阴离子交换树脂 二乙基（2—羟丙基）—氨基乙基 中强碱型：二乙基氨基乙基 弱碱型：氨基乙基、对氨基苯甲基 蛋白质纯化常用的离子交换剂 蛋白质纯化常用亲水性离子交换剂。因为亲水性离子交换剂对生物大分子物质的吸附和洗脱均较温和，被分离纯化的物质不易被破坏。 纤维素类：纤维素离子交换剂是最早用于生物大分子分离的介质，它具有松散的亲水网络，大孔隙、表面积大等优点。但因以无定型为主，故很难用于层析柱操作。DEAE-Sephacel 是经特殊交联处理制成的珠状离子交换纤维素。 葡聚糖系离子交换介质：主要以Sephadex系的产品为主，它是在Sephadex G25及G50两种凝胶过滤介质上引入功能基后，产生的多种离子交换介质。该类介质容量大，价格较低，但由于流速、体积受外界影响较大，逐渐被新一代的BioProcess凝胶所代替。 琼脂糖系（agarose)：琼脂糖凝胶介质上引入功能