执业医师最新最全考点解析系列生物化学部分第十三节重组DNA技术..docxVIP

第十三单元　重组DNA技术本单元考点　1.重组DNA技术的概述　（1）重组DNA技术相关的概念　（2）基因工程的基本原理　2.基因工程与医学　（1）疾病相关基因的发现　（2）生物制药　（3）基因诊断　（4）基因治疗　（5）遗传病的防治　重组DNA是指不同来源的DNA分子通过末端共价连接形成重新组合的DNA的过程。　 第一节　概　述　一、相关的概念　（一）DNA克隆　来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合称克隆。　获取同一拷贝的过程称为克隆化，即无性繁殖。　应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA连接，合成具有自我复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子的过程，也称基因克隆或重组DNA。　实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。　（二）限制性核酸内切酶　是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。　限制性核酸内切酶可以把DNA切成长度不同的片段，是重组DNA中重要的工具酶。　如Bam HⅠ　　（三）目的基因　应用DNA重组技术的目的：　分离、获取某一感兴趣的基因或DNA序列；　获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）。　这些感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因。　即纯化的特定基因（靶基因）。　（四）基因载体　游离的外源DNA是不能复制的，需将外源基因连接到有自我复制及表达能力的DNA分子上。　基因载体：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达的有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。　在重组DNA中常用的载体包括质粒DNA、噬菌体DNA、柯斯质粒载体（粘粒）、病毒DNA和人工染色体等类型。　载体分为克隆载体和表达载体　为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。　为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。　二、基因工程基本原理　　（一）目的基因的获取　目的基因主要有以下几种来源：　1.cDNA文库　以mRNA做模板通过反转录的方式获得的DNA。　2.基因组DNA文库　用限制性内切酶切割组织或细胞染色体，得到所需DNA基因片断。　3.聚合酶链式反应（PCR）　用体外快速扩增方法得到所需目的基因。　4.化学合成法　已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列用DNA合成仪合成。　（二）克隆载体的选择　克隆载体的选择的标准：　①能自主复制；　②具有两个以上的遗传标记物便于重组体的筛选和鉴定；　③有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；　④分子量小，以容纳较大的外源DNA。　（三）外源基因与载体的连接　目的基因与载体DNA片段连接成一个完整的重组体分子。　连接方式有以下几种：　1.粘性末端连接。　　　2.平端连接。　限制性内切酶切割产生的平端、粘端补齐或切平形成的平端。　　3.同聚物加尾连接。　在末端转移酶的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。　4.人工接头连接。　由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。　（四）重组体DNA导入受体菌　1.受体菌条件　（1）安全宿主菌。　（2）限制酶和重组酶缺陷。　（3）处于感受态。（在0-4℃下用氯化钙处理增加细胞膜的通透性成为感受态细胞）。　2.导入方式：转化、转染和感染。　通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细菌或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用。　真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程称为转染。即将表达载体导入真核细胞的过程。　（五）重组体的筛选　外源重组DNA导入宿主细胞后，首要任务是要筛选含有目的基因的转化菌并加以扩增。　1.直接选择法　（1）抗药性标记选择　是筛选重组体最常用的方法。　R如重组体携带某种抗药性标志基因，只有含这种抗药基因转化的细菌才能在含有该抗生素的培养板上生存并形成菌落，据此可筛选出转化菌。　（2）标志补救　转化或转染的外源基因表达产物可弥补基因缺陷性宿主菌的性状，可以利用营养突变菌株进行筛选。　（3）分子杂交法　用与外源DNA互补的放射性核素标记探针与重组子DNA进行杂交筛选。　① 原位杂交：将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。　使用DNA或RNA探针检测与其互补的另一条链在细菌或其他真核细胞中的位置。　②Southern印迹：将待测核酸样品结合在硝酸纤维素膜上，再与溶液中的探针杂交。含有目的基因的重组DNA与探针结合而被放射性核素标记。　2.免疫学方法筛选：　利用特异抗体与目的基因的表达产物（作为抗原）之间相互作用进行筛选，不是直接鉴定靶基因。可分为免疫化学方法及酶免检测分