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一种快速有效的细菌鉴定方法 传统的细菌鉴定方法是根据微生物的细胞形态、生理生化特征、血清学反应、噬菌体敏感性等多方面进行综合鉴定的，使用该方法进行鉴定的依据为细胞的表形特征，其缺点是检测项目多、工作量大、耗时、结果不稳定等，易出现弱反应或假阳性。 现代的方法：利用了PCR的方法，根据16s rDNA两端的保守序列，设计引物PCR扩增未知细菌的16s rRNA基因，然后对PCR扩增的DNA片段进行序列分析，经与GenBank中的已知序列进行同源性比较后，对未知菌种进行鉴定。该方法是在分子水平上对细菌进行的分类，具有快速、准确、重复性好等优点。 鉴定的原理 细菌的rRNA是细胞内含量最多的RNA，约占总量的80%以上，其分子量大，种类多，由高度保守区和可变区组成。细菌的rRNA包括5S、16S、23S，其中5S rRNA信息量少，不适合分析；23S rRNA分子大，信息量多，但碱基突变速度较快，同样不适于细菌鉴定；相比之下16S rRNA的遗传较为稳定，长度在1550±200bp左右,代表信息量适中，是研究系统进化的好材料。目前已报道了10000种以上的细菌16S rDNA序列，通过对16S rDNA序列分析，可以将细菌划分到属或种，对于难以培养的细菌、生化反应不明显及传统表型方法不能鉴定的细菌，使用该法鉴定细菌尤为方便。 本文以某食品公司的食品原料和加工后成品中的细菌检测为例，简述细菌鉴定的方法。 1.细菌分离及基因组DNA的制备 细菌分离：使用平板记数的方法对食品原料及加工后成品中的细菌进行分离。 基因组DNA的制备：从食品原料的琼脂平板上挑出10个单菌落（分别编号1-10），从加工后成品的琼脂平板上挑出7个单菌落（编号11-17 ），采用细菌少量提取基因组DNA试剂盒提取各个样品的基因组DNA。 2. PCR扩增 2.1 按下述组分配制PCR反应液 模板*： 1μl PCR Premix 25 μl Forward Primer 0.5 μl Reverse Primer 0.5 μl 16S-free H2O up to 50μl *阴性对照使用1 μl的16S-free H2O替代模板DNA 阳性对照使用1 μl的Positive Control DNA为模板 2.2 PCR反应条件如下： 94℃ 5min 94℃ 1min 50℃ 1min 30cycles 72℃ 1.5min 72℃ 5min 3 琼脂糖凝 胶电泳 使用1%的琼脂糖进行电泳，结果如下。电泳结果显示，从食品原料和加工后成品中的17个细菌中，均扩增出了16SrDNA的DNA条带。 4 PCR产物的琼脂糖凝胶回收 使用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 对PCR扩增的产物进行了切胶回收，纯化目的片段。 5 DNA测序 对切胶回收纯化的各PCR扩增产物使用Seq forward, Seq internal, Seq reverse 三条引物进行测序。 结果分析： 细菌的16SrDNA序列对比结果表明：在食品原料中含有的细菌种类比较多，共有9种；但灭菌后的食品中只含有3种，主要是芽孢细菌。通过菌种鉴定发现，成品中出现的芽孢菌从原料中并没有检测出来，可能的原因是：此种细菌在原料中并不是主要的菌群，经过高温灭菌后其他菌体死亡，而此种细菌并没有被完全杀死，发展成了主要细菌。因此可以推断：食品的污染可能是灭菌不彻底造成的。特别是芽孢细菌，一般比较耐热，高温高压只能杀死菌体，对于菌体产生的芽孢休眠体可能未能杀死，造成食品污染。 解决方案： 根据以上的结果分析：建议采用如下方法对食品原料和成品进行处理： 1、减少食品的包装，不改变原有的灭菌条件，以免破坏食品风味。 2、对食品原料采用两次灭菌的方法。第一次灭菌将菌体杀死，然后到休眠芽胞萌发成菌体后，进行二次灭菌。 3、在食品中加入可食用的天然防腐剂,如：NISIN（一种34个氨基酸组成的小肽，进入肠道后可被消化，且耐高温，性质稳定）等，用来抑制芽孢杆菌等难以杀灭细菌的繁殖。 * 11-17 成品中分离细菌的16SrDNA PCR扩增结果 — 阴性对照（以16S-free H20为模板） + 阳性对照（以Positive Control DNA为模板） 1-10 原料中分离细菌的16S rDNA PCR扩增结果 — 阴性对照（以16S-free H20为模板） +