细胞膜结构与功能2015课件.pptVIP

内膜 F0F1 ATP酶 e- ADP+Pi 底物 H+ ATP H+ H+ H+ 基质 膜间隙 电子传递链 电子传递的自由能驱动H+从线粒体基质跨过内膜进入到膜间隙，从而形成H+跨线粒体内膜的电化学梯度，这个梯度的电化学势( Δ?H+ )驱动ATP的合成。 化学渗透假说(chemiosmotic hypothasis) O2 H2O 化学渗透假说模型 线粒体外间隙 基质 琥珀酸 延胡索酸 ADP+Pi ATP NADH+H+ NAD+ 4H+ 2H+ 4H+ 内侧呈碱性pH产生化学能 质子迁移驱动ATP合成 内侧呈负电性产生电极电势 线粒体外膜 线粒体内膜 H+ H+ ATP合酶结构示意图 ? ? ? OSCP ? F1 H+通道 ? ? ? ? FO 柄 DCCD结合蛋白 内膜外侧 内膜内侧 ? OSCP:寡霉素受体敏感蛋白，DCCD:二环己基碳二亚胺 Racker的氧化磷酸化重建示意图（1963年） ATP合成的结合变化机制和旋转催化机制 1994年英国科学家Walker发表的高分辩率的牛心线粒体ATP酶晶体的三维结构， 证明在ATP酶合成ATP的催化循环中三个β亚基的确有不同构象， 有力地支持了Boyer的假说。 1977年美国科学家Boyer提出提出结合变化机制(binding change mechanism)，认为 ATP合成酶β亚基有三种不同的构象，一种构象(L)有利于ADP和Pi结合，一种构象(T)可使结合的ADP和Pi合成ATP，第三种构象(O)使合成的ATP容易被释放出来.在ATP合成过程中，三个β亚基依次进行上述三种构象的交替变化，所需能量由跨膜H+提供。在此基础上，1993年Boyer又提出提出旋转催化理论(rotation catalysis mechanism)，更好地解释了ATP酶作用机理。 Boyer和Walker与Skou共同分享1997年诺贝尔化学奖。 结合变化机理示意图 ADP+Pi Proten Flux H+ ATP +H2O ADP+Pi Proten Flux 有于ADP与Pi结合的构象 有于ADP与Pi生成ATP的构象 有利于ATP释放的构象 ATP ATP ATPase的旋转催化模型 线粒体内膜 ATP ADP+Pi b 内侧 外侧 H+ FO F1 旋转催化理论认为当质子流通过Fo单元返回基质时，触发了C亚基的旋转， C亚基带动?、?以至(??)3复合物一起旋转，使? 和?亚基发生构象变化,从而导致ATP的合成。 ?亚基的中心? -螺旋被认为是转子, a、b与?亚基组合在一起组成定子,它压住? /?异质六聚体。 C ? ? a ? ? ? ? ? ? ? ATPase的旋转催化机制的其它实验证据 1、Cross实验室根据牛心线粒体F1—ATPase的晶体结构，用基因工程方法在?亚基上靠近?亚基的地方引入一个Cys残基，使得单个?亚基与?亚基之间能形成专一的二硫键交联。这个二硫键使?亚基与?亚基不能旋转，完全终止了ATPase的催化能力… 2、Yashida实验室利用F1-ATPase晶体结构的结果，精心设计了一系列的标记、突变，用最新的荧光显微镜摄象技术，把的?亚基旋转运动展现出来。 Cross实验室为证明旋转催化机制设计的实验 制备? D380C –F1 ? ?T HS ?L HS ?O HS HS ? ?T S ?L HS ?O HS S ? ?T S ?L HS ?O HS S * * * ? ?T S ?L HS ?O HS S * * * ? ?O HS S ?L S * * ?T HS * * ? ?L HS ?O S S * ?T HS * 形成?- ?间二硫键 与放射性标记的?亚基重组 解离、分析?- ?中的放射性 重新氧化形成二硫键 加入Mg、ATP使酶催化 亚基解离 还原?- ?间二硫键 ? ? ? ? ? ? Cover-slip His-Tag Ni-NTA Biotin Streptavidin Actin filament Yashida实验设计及观察F1—ATPase旋转所用的系统 突变1：在?亚基N-端加上10个His组成的尾巴； 突变2：把?亚基107Ser突变成Cys; 突变3:把?亚基中唯一的193 Cys突变成Ser. 把三个亚基突变体在E.coli中高效表达，分离、提纯后重组 将?3 ?3通过?亚基上的His10尾巴固定在涂有Ni-NTA的玻板上，将荧光标记的肌动蛋白单纤维丝通过生物素和链霉抗生物素蛋白连接在?亚基107位的Cys上 2.5?m F1-