改良Lowry氏法测蛋白含量.pptVIP

生物化学与分子生物学系 陈园园 yuanyuan_work@ 生物化学实验 实验室规则 按规章操作，保障实验安全； 进入实验室要着白大衣； 禁止大声喧哗，保持实验环境的安静； 维持实验室的整洁。 ? 实验课的考试 ? 实验分组 ? 实验室卫生 ? 实验报告的书写 实验名称 姓名： 班级： 学号： 实验原理： 实验目的： 实验步骤：文字简洁，尽可能采用图表 实验结果：原始数据、计算过程、结论 实验讨论：结果分析、实验注意事项 实验日期： 同组人员： 实验报告的书写 一、玻璃仪器的常规清洗 二、试剂瓶、吸量管、试管的放置 基 本 操 作 三、刻度吸量管的使用 分光光度计 分光光度计的原理 分光光度计的操作 T = I/I0， A = - lg T 1、A1/A2= c1/c2 2、标准曲线法 Lambert-Beer 定律 A = KcL 分光光度计的原理 I0 I L K：吸光系数 c：溶液浓度 L：溶液厚度 C 光 源 I0 I 单色器 样品池 狭缝 检测系统 分光光度计的构造 分光光度计的使用 1. 打开电源，调节旋钮至需要的波长，预热20~30min 2. 1档（空白管），T模式调100%，显示“Blank”、“100” 3. 拉杆拉至1.5档，T模式调0%，显示“0.00” 4. 切换到A模式，拉至2、3、4档，读取各个样品的吸光度 5. 使用完毕后，置于休息档（1.5档） 拉杆，1-4档 样品池 读数 波长 1档，空白对照，A=0，T=100% 1.5档，隔板，A=+∞，T=0% 2档，样品1，A=？ 3档，样品2，A=？ 4档，样品3，A=？ 1、分清光面、毛面 手只可接触毛面，光线须从光面通过 2、用溶液润洗2-3次，装至2/3至4/5体积 3、粗纸吸水、柔纸擦亮光面 4、从低到高依次测量，不需清洗比色杯 5、蒸馏水冲洗3-5次，擦干，倒扣放置 比色皿的使用 毛面 光面 改良Lowry氏法测定 蛋白质含量 实 验 1 实 验 目 的 1、学习改良Lowry氏法测定蛋白质含量 的原理及方法 2、了解标准曲线在物质定量测定中的 应用及绘制要点 实验原理 凯氏定氮法 16% 紫外吸收 280nm 呈色反应 Pr. Cu2+ OH- Pr-Cu2+ 螯合物 (紫红色) 酚试剂 钼蓝-钨蓝混合物 (蓝色，深浅与蛋白含量呈正比) （双缩脲反应） Pr. Cu2+ 改良Lowry法 费时较长，而且要精确控制操作时间。 显色程度与时间有关。 专一性较差，干扰物质较多。 灵敏度高 双缩脲法的检出限为 0.2~1.7 mg/ml， 而本法的检出限为0.015~0.110 mg/ml。 优 点 缺 点 实 验 步 骤 试剂 （ml） 蛋白标准品 样品 测定管 0 1 2 3 4 5 Pr标准液 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 待测血清 1.0 生理盐水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 试剂A 0.9ml, 混匀后，37℃水浴10min 试剂B 0.1ml, 混匀后，室温放置10min 试剂C 3ml, 立即混匀，37℃水浴10min 0 x1 x2 x3 x4 Y3 OD650 蛋白质量（mg）/蛋白浓度（mg/ml） 1、标准曲线的绘制和实测样本浓度的求得 Y2 Y1 样品吸光度 样品浓度 实 验 结 果 2、浓度换算 样品体积 实测蛋白质量 待测蛋白浓度（g/L）= 实测蛋白浓度 ╳ 稀释倍数 待测蛋白浓度（g/L）= ╳ 稀释倍数 注意 终体积相同的前提下，可以用质量代表浓度 例如：1号管中，蛋白质量为0.02mg，而其终浓度为0.004mg/ml 注意溶液的稀释倍数 例如：若以浓度为横坐标，根据吸光度得到实测蛋白浓度为0.02mg/ml, 则待测蛋白浓度= 0.02mg/ml x 5 x 1000=100mg/ml 若以质量为横坐标，根据吸光度得到实测蛋白质量为0.1mg, 则待测蛋白浓度= (0.1mg/1ml) x 1000=100mg/ml 未知浓度蛋白溶液 实测蛋白溶液 1ml 终体积 5ml 测吸光度 1:1000稀释 加入A、B、C试剂 计算出终浓度 c 实测蛋白浓度为 cx5 未知蛋白浓度为 cx5x100