分子学：DNA RNA技术课件.ppt

rRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列，特别是28S和18S特征性条带是电泳鉴定总RNA纯度和完整性的重要参数。 Li Q et al. (2006) J. Integr. Plant Biol. 48: 114-120. 图5-14 PolyATtract mRNA的分离纯化过程简图。 RNA的浓度和纯度可以通过测定其OD260和OD280 来判断。OD260为1时相当于浓度为40μg/ml，而OD260/OD280的比值如果在1.8-2.0之间，表示所提取的RNA纯度较好，如果样品中有蛋白质或酚污染，则OD260/ OD280的比值将明显低于1.8。 由于RNA分子敏感脆弱，在自然状态下难以被扩增，为了研究mRNA所包含的功能基因信息，一般将其反转录成稳定的DNA双螺旋（cDNA，complementary DNA），再插入到可以自我复制的载体中。 图5-15 cDNA合成过程示意图。 图5-16 定向cDNA 合成及分子修饰 因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有5-甲基胞嘧啶的外源DNA，所以实验中常选用mcrA- mcrB-菌株以防止cDNA被降解。 cDNA文库的构建 cDNA的长度一般在0.5-8 kb之间，质粒载体和噬菌体类载体都能满足要求。 cDNA文库常用Uni-zap XR（一种λ噬菌粒载体）做载体，它具备噬菌体的高效性和质粒载体系统利用蓝白斑筛选的便利，可容纳0-10 kb DNA插入片段，含有pBluescript载体的全部序列。 重组后可通过体内剪切反应（In Vivo Excision）将cDNA插入片段转移到质粒系统中进行筛选、克隆和序列分析。 经PCR扩增产生的主要是线性双链DNA分子，它是由左侧序列和右侧序列首尾连接而成，其接点是（1）中所用的限制性内切酶的识别位点。 TAIL-PCR（Thermal Asymmetric Inter-Laced Polymerase Chain Reaction） 热不对称交错多聚酶链式反应。常用于扩增T-DNA插入位点侧翼序列，从而获得转基因植物插入位点特异性分子证据。 TAIL-PCR主要用于分离毗邻已知序列的未知DNA序列，使用两个长度不同因而退火温度也不相同的引物。高退火温度的PCR循环有利于由长引物引起的DNA扩增，低温循环时两个引物的扩增效率基本相同。 TAIL-PCR使用一套巢式（nest）特异引物（T-DNA边界引物，TR）和一个短的随机简并引物（AD）。 第一轮反应（Primary reaction）是TAIL-PCR的重要环节，先进行5轮高严谨性循环，特异性引物与模板退火，只能发生单引物循环，T-DNA上游侧翼序列得到线性扩增。 大幅度降低退火温度，使AD及TR均与模板DNA相结合，指数扩增一个循环。 此后，两个高严谨、一个低严谨循环交替进行，共15个循环。特异性序列（两端分别拥有TR1和AD序列）和非特异性序列I（只有TR1，没有AD序列）大大超过特异性序列II （两端均为AD序列）。 PCRII中，特异性序列再次被优先扩增，经稀释的非特异性序列I也已大为降低，此时已没有明显的背景片段了。 PCRIII是真正意义上的PCR，共20个循环，进一步扩增特异性序列。 TAIL – PCR 反应流程 RACE技术（rapid amplification of cDNA ends） 在已知cDNA序列基础上克隆5’或3’端缺失序列的技术。根据已知序列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外侧进行PCR扩增得到目的序列。用于扩增5’端的方法称为5’RACE，用于扩增3’端的称为3’RACE。 5’ RACE 在反转录酶的作用下，以基因片段内部特异性引物（GSP1）启始cDNA第一条链合成。 RNase降解模板链mRNA，纯化第一链。 用末端转移酶在cDNA链3‘端加入连续的dCTP。 以连有oligo(dG) 的锚定引物和基因片段内部特异的nested引物进行PCR扩增，得到目的片段，用nest PCR检测。 3’RACE 1、用oligo(dT)锚定引物启始cDNA第一链的合成. 2、降解模板mRNA. 3、用通用锚定引物和基因片段内部特异引物进行PCR扩增得到目的3’片段，用nest PCR法检测. 5. 2. 4 实时定量PCR （real time quantitative PCR，Q-PCR） 由于PCR敏感性高，扩增产物总量变异系数大，定量不准确。90年代末期出现了Q-PCR， 利用荧光检测PCR仪绘制DNA扩增过程中的累积速率动态变化图，基本消除在测定终端产物丰度时变异系数较大的问题。 混合在PCR反应液中的荧光探针只有与大片段DNA结合后，才能够被激发出荧光。 随着新合成DNA片段的增加，由于结合到DNA上的荧光探针