4 人工染色体载体课件.ppt

能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞； 能像质粒那样在受体细胞中自主复制； 重组操作简便，筛选容易； 装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围； 不能体内包装，不裂解受体细胞。 ②大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子。 结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出30～45kb的外源DNA插入载体DNA，此时，每个载体只可能插入一个外源片段，因为如果二个片段，则将超过包装成噬菌体颗粒的限度； ③细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌落很费时间。 　 现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯质粒制成的基因文库常常不太稳定，插入的大片段外源DNA有可能通过同宿主基因组交换而致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。 主要结构： ①两个可在酵母菌中利用的选择基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因)； ②酵母菌着丝粒序列 (centromere4,CEN4)； ③一个自主复制序列(ARS1)； ④两个来自嗜热四膜虫 (Tetrahymenna thermophilp)的末端重复序列(TEL)，以保持重组YAC为线状结构； ⑤在两个末端序列中间，有一段填充序列(HIS3)，以便pYAC4在细菌细胞中稳定扩增； ⑥Amp抗性及细菌质粒复制原点； ⑦一个EcoRⅠ克隆位点，该位点位于酵母菌Sup4 tRNA基因内。 Sup4基因编码赭色抑制Trp-tRNA，抑制赭色表型(成为白色)。 不含外源DNA片段的pYAC4载体转化酵母菌，转化子的菌落呈白色。 带有插入的外源DNA片段的pYAC4重组载体，其Sup4已经失活，结果转化酵母菌后所产生的转化子形成赭色菌落。 一般酵母表达载体都以大肠杆菌质粒为基本骨架再加上酵母的自主复制序列，选择标记，外源基因插入位点，启动子和终止子。 既能在酵母菌中复制也能在大肠杆菌中复制，所谓酵母菌—大肠杆菌穿梭载体。 ①启动子和终止子的选择； ②表达盒的稳定性； ③外源蛋白的累积部位； ④产量的提高。 pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)是一类酵母穿梭载体。 　　YAC具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。此外，YAC还具有酵母菌染色体的一些特点。可以接受100-1000kb的外源DNA片段。 第二节 酵母人工染色体载体 pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 　　这种人工染色体克隆载体实际上是一种“穿梭”克隆载体，含有质粒克隆载体所必备的第一受体(大肠杆菌)源质粒复制起始位点(ori)，还含有第二受体(如酵母菌)染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。 第二节 酵母人工染色体载体 pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 一、YAC载体的复制元件和标志基因 YAC载体应含有下列元件： 酵母染色体的端粒序列 酵母染色体的复制子 酵母染色体的着丝粒序列 酵母系统的选择标记 大肠杆菌的复制子标记 YAC载体的装载量为　250 - 400 kb 这样的克隆载体在第一受体细胞内可以按质粒复制形式进行高拷贝复制。 这种克隆载体在体外与目的DNA片段重组后，转化第二受体细胞，可在转化的细胞内按染色体DNA复制的形式进行复制和传递。 　　　筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素抗性选择标记； 　　筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补的营养缺陷型。 人工染色体克隆载体的特点： 　　能容纳长达1000 kb甚至3000 kb的外源DNA片段。 人工酵母染色体克隆载体的构建 　　YAC(酵母人工染色体)克隆载体是最早构建成功的人工染色体克隆载体。 　　将酵母染色体DNA的端粒(TEL)、DNA复制起点 (ARS)和着丝粒(CEN)以及必要的选择标记(HISA4和TRPl)基因序列克隆到大肠杆菌质粒pBR322中，构建成YCA克隆载体。 pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 二、YAC载体的工作原理 EcoRI EcoRI EcoRI BamHI 连接 转化酵母菌 重组酵母染色体 　　此克隆载体的sup4(抑制基因：抑制赭色表型 )基因上，组装了供插入外源DNA片段的克隆位。 常用的YAC克隆载体有3种： pYAC3、pYAC4和pYAC5。 差别：