液相色谱分析方法的建立.docVIP

一.??方法建立的步骤 二．开始前应知道 1.?样品的性质 在开始方法建立之前，我们应该检查自己对样品的了解程度，并明确分离目标。 表?1?有关样品组分和性质的重要信息 所含化合物的数目 化合物的化学结构（官能团） 化合物的分子量 化合物的pKa值 化合物的UV光谱图 化合物在样品中的浓度范围 样品的溶解度 样品的化学成分能够为选择HPLC分离的最佳初始条件提供有价值的线索根据已知的样品信息，HPLC方法建立有两种不甚相同的模式。一种模式依据样品的“化学性质”选择最佳初始条件，色谱工作者需很大程度依赖于过去的经验（如类似结构化合物的分离）和/或用文献资料补充现有信息而另一种模式则直接开始色谱分离，而对样品的性质不大注意这两种HPLC的方法建立模式可分别称为理沦型与经验型初始分离一旦开始，可以根据类似的思路（理论的与经验的）选择进一步的实验。 2.分离的目的 HPLC分离的目的必须十分明确，下面的问题在建立方法之初就应确定： （1）主要目的是什么？定量或定性，还是定性、定量同时做？； （2）是否有必要解析出样品的所有成分？譬如可能有必要分离出产品中的所有降解物或杂质，以使含量测定结果更加可靠，但却没必要将它们彼此完全分开。 （3）如要求定量分析，准确度与精密度需多大？样品主要成分的精密度通常能达到±1—2%，特别是不需样品预处理的情况。 （4）特殊化合物可能会以不同的样品形式出现（如：原料药，一种或多种形态，环保样品等）。是否需要一种以上的HPLC方法？单一方法分离不同形态样品是否理想？ （5）一次将分析多少样品？当必须同时处理大量样品时，运行时间将变得非常重要。有时甚至为了缩短运行时间而以牺牲样品分离度作代价，如缩短柱长或加快流速。当一次分析的样品数目超过10个，运行时间一般应控制在20min以内。 （6）将要使用该方法的实验室中，有哪些HPLC设备？色谱柱能否恒温系统能否做梯度洗脱？该方法是否可在不同设计与生产的设备上运行？ ????方法建立实验开始之前，应明确对方法的这些要求。 三.?样品的预处理和检测 ??1.??预处理：样品来源形式不同，可能以如下形式出现： ??????（1）?可直接进样的溶液；: ??????（2）?需稀释、pH缓冲、加人内标或其它定容操作的溶液； ??????（3）?必须首先溶解或提取处理的固体；。 ??????（4）?样品需预处理以除去干扰物和/或保护色谱柱或仪器不受损害。 ???可直接进样的样品有操作方便、精密度好的优点，然而大多数HPLC分析的样品需称重或稀释定容后才能进样。当样品溶剂成分接近于流动相时，一般不会产生基线波动等问题，通常能够得到较好的结果。有些样品在注入HPLC前需进行部分分离（预处理），以除去干扰物、浓缩样品或消除“柱杀手”，因此了解样品和各种被测物的浓度范围非常重要。 ??2.??检测：HPLC方法建立期间，在第一次进样前，我们必须有把握所选择的检测器能检测到所有的被测样品组分。通常首选可变波长紫外(UV)检测器，因这种检测器使用方便，且可用于大多数样品。UV光谱数据可从文献中查找，也可通过所测样品成分的化学结构估算，直接测得（如果可拿到化合物纯品）或在HPLC分离期间用二极管阵列检测器（PDA）得到。样品对UV检测响应不足时，可考虑使用其它类型检测器(荧光，电化学等)，或衍生化样品使检测信号增强。 四.?建立分离方法 1.?选择HPLC分离模式与起始条件 首先，我们要确定使用什么方法最合适；如果我们选定HPLC分离模式，将样品分为一般样品或特殊样品。一般样品为小分子典型混合物，用近乎标准化的起始条件即可分开。而样品特殊需用特殊的色谱柱和特定的条件才能很好地分离。 一般样品可进一步分为中性或离子样品。离子样品包括酸、碱、两性化合物和有机盐类(电离的强酸或强碱)。如样品为中性，一般不需在流动相中加缓冲液或添加剂，但对于酸或碱性样品，通常需在流动相中加入缓冲剂。碱性或阳离子样品，推荐用“弱酸性”的反相色谱柱，流动相中加人胺添加剂可能对分离有利。首次实验完成后，再按照结果系统地加以进一步完善。 样品的性质 HPLC????????GC?????????CE?????????SEC????????TLC 一般样品?????????????????特殊样品 中性的??????????离子的?????????无机离子 异构体? ?????????????????????????????对映体 生物样品 等??度????????????????????肽?类 糖?类 梯??度?????????????????大分子 蛋白质 离子对????????????????????核??酸 糖??类 正??相??????????????????合成聚合物 图1.?利用样品的有关条件