鼠伤寒沙门氏菌、哺乳动物肝微粒体致突变性实验概论.ppt

实验步骤与方法 1 实验用菌液制备 平板菌落计数法，是种统计物品含菌数的有效方法。方法如下：将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液涂布到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞；统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。 2 菌株性状鉴定 （1）组氨酸营养缺陷型 （2）深粗糙突变测定 （3）R因子的鉴定 （4） 切除修复缺失鉴定 （5）自发回变量测定 （6）回变特性鉴定 结果与报告 1 实验结果判断与评价 （1）点试法 凡在点样纸片周围长出一圈密集的his回变菌落者，该物质具有致突变性，即为阳性；如只出现少数散在菌落，则为阴性。 （2） 掺入法 突变率=诱发回变his菌落数/自发回变his菌落数 确认待测物具有致突变作用，必须具有以下几点： ①诱发突变His+菌落数为自发回变His+菌落数的2倍或2倍以上 ②回变菌落数随剂量增加而增加，并在一定剂量范围内剂量效应曲 线 呈直线 ③有可重复性 ④ 经统计学处理有显著差异 * Company name 毒理学基础实验课 LOGO 毒理学基础实验课 毒理学基础实验课 鼠伤寒沙门氏菌微粒体酶试验 Ames test 原 理 鼠伤寒沙门氏菌 野生型（原养型） 人工方法正向诱变 鼠伤寒沙门氏菌 组氨酸缺陷型（异养型） 诱变物作用回复突变 Ames是检测遗传毒理学的体外试验，检测终点是基因突变 通过统计回复突变的菌落数 判断受试物质的致突变性高低 S-9混合液的制备过程（使需要代谢激活的物质得以活化） 2 5 3 4 1 暴露肝脏，KCL灌注 断头处死大鼠、放血、去皮 取出肝脏，加入KCL剪碎 制成匀浆，9000g离心 取上清、分装、冻存 深粗糙（rfa）特性 2 紫外线敏感（UvrB）特性 3 抗氨苄青霉素（R因子）特性 4 回变特性鉴定 6 组氨酸需求特性 1 菌株特性鉴定 自发回变特性 5 1、组氨酸需求特性 有细菌生长 空白 空白 组氨酸-生物素 赖氨酸 空白 37℃ 24h 0.1ml菌液 顶层 底层 菌株特性鉴定 2、深粗糙（rfa）特性 0.1ml菌液 顶层 普通培养基 抑菌环 滤纸片（有结晶紫） 37℃24h 菌株特性鉴定 3、紫外线敏感特性 普通培养基 15W紫外灯 33cm，8s 37℃，24h 菌株特性鉴定 4、抗氨卞青霉素（R因子）特性 37℃，24h 青霉素 普通培养基 菌株特性鉴定 5、自然回变特性 0.1ml菌液 顶层 底层 37℃，24h 菌株特性鉴定 240-320 + - + + + TA102 120-200 + - + + + TA100 30-50 + - + + + TA98 90-180 + - + + + TA97 自发回变 （-S9） uvrB修 复缺陷 抗四环素 抗氨卞西林 脂多糖 屏蔽缺失 组氨酸缺陷 基因型 菌株 Ames试验菌株特性 6、回变特性鉴定 0.1ml菌液 0.1ml致突变物 0.2-0.5mlS-9 顶层 底层 37℃，24h 菌株特性鉴定 实验设计原则 受试物最低剂量为每皿0.1μg 一般选用4~5个剂量 每个剂量应做2或3个平行平皿 设立阳性对照和阴性（溶剂）对照 受试物最高剂量为每皿5mg Ames试验设计 点试法 将顶层培养基倒入底层培养基中，凝固后放入滤纸片，将受试物点在纸片上放入底层，37℃培养48h观察结果 掺入法 将受试物0.1ml、菌液0.1ml分别加入顶层培养基中，倒入底层培养基中，凝固后37℃培养48h观察结果 Ames试验方法及结果评价 点样纸片周围长出一圈密集的His+回变菌落者，受试物即为阳性致突变物质。 背景菌生长良好受试物每皿回变菌落数增加一倍以上并有剂量-反应关系，试验结果具有重现性即可认为该受试物为诱变阳性。 四 注意事项