Gene20101007课件.ppt

免疫分子的基因工程和蛋白质工程 北京大学人类疾病基因研究中心 王 应 应用 基因功能研究 药物开发研究： 主要包括多肽药物、蛋白质药物和核酸药物 诊断试剂开发研究： 基因诊断、免疫诊断 基因工程 一、概述： 基因工程（Genetic Engineering）特指外源基因在工程细胞表达的技术，利用不同种属间的遗传密码是通用性的特点，将一个种属的基因转移至另一种属，并使其表达。 20世纪70年代末，随着基因工程技术蓬勃兴起，大大推动了蛋白质分子的结构和功能研究，和重组药物的研究和开发。 基因工程主要内容： 二、外源基因表达系统: 表达载体： 质粒（plasmid）： 噬菌体（phage）: 动物病毒： 昆虫病毒：杆状病毒 植物病毒：烟草花叶病毒 工程细胞： 大肠杆菌： 酵母菌： 哺乳动物细胞： 昆虫： 植物： 动物： 三、外源基因在大肠杆菌表达： 1．启动子： 功能： RNA聚合酶结合部位的序列，起始mRNA转录 原核RNA聚合酶不能识别真核细胞启动子 真核基因克隆在原核启动子下游，带动真核基因在原核细胞中转录 强启动子是大肠杆菌表达的前提，构建载体时，已人为加上了。 大肠杆菌表达系统常用强启动子： 乳糖启动子Lac 乳糖和色氨酸的杂合启动子Tac ?噬菌体左向启动子?PL（PL左向，PR右向启动） T7噬菌体启动子 启动子的调控： Lac、Tac启动子：来自大肠杆菌乳糖操纵子 LacIq高水平表达lac阻抑蛋白，结合到操纵基因上，阻止转录； 诱导物与lac阻抑蛋白结合，开放lac启动子，诱导外源基因转录与表达： 诱导物： 乳糖； 异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）； 硫甲基半乳糖苷（TMG）； 邻硝基本基半乳糖苷（ONPG） 2．Shine-Dalgarno序列?SD序列：J. Shine和L. Dalgarno，1974年首先发现 功能：核糖体结合位，位于起始密码AUG上游3-11bp处，3-9bp组成 E.coli边转录，边翻译，构建载体时，加在真核基因前。 3．终止子： 特点： ①A/T丰富区与G/C丰富区交替 ②G/C丰富区具回文对称结构 转录mRNA形成茎环二级结构，与RNA聚合酶作用导致酶构象改变，停止向下游移动及磷酸二脂键形成 功能： ①RNA聚合酶不再继续进行转录RNA； ②转录mRNA从模板上释放； ③RNA聚合酶也从模板上释放下来。 4．读码框架： 融合蛋白：外源基因插入时，要与读码框架吻合。 5．密码子使用： 43→64，去掉终止密码子，有61个，编码20种氨基酸 CGU,CGC使用频率高 CGA，CGG，AGA，AGG使用频率低 弱密码子，数量多但表达低 6．防止重组蛋白的水解： 防止方法： 以融合蛋白表达：N端为一段大肠杆菌蛋白； 用蛋白酶基因缺陷的菌株，如BL21，不含lon和OmpT蛋白酶，使外源基因蛋白更稳定，高效表达。 7．无内含子：原核表达无剪切。 8．信号肽：插入基因成熟肽编码序列。 8．信号肽：插入外源基因成熟肽编码序列。 四、外源基因在哺乳动物细胞中表达 载体 非病毒载体：质粒型表达载体 含来自病毒的调控区； 不含病毒基因组编码区； 转染方式进入哺乳动物细胞，克隆在载体中的外源DNA可以表达； 不能产生病毒颗粒。 病毒载体 携带外源基因并能包装成病毒颗粒； 感染方式进入哺乳动物细胞，介导外源基因的转移和表达； 对机体不致病。 哺乳动物细胞质粒表达载体基本结构 1．复制起始点： 细菌复制起始点： 可在大肠杆菌中复制扩增，穿梭质粒 穿梭载体（shuttle vectors）：近年来发展了许多人工构建的能用于微生物、酵母、植物等的质粒载体。含有不止一个ori，能携带插入序列在不同种类宿主细胞中繁殖的载体。 哺乳动物细胞复制起始点： SV40复制起始点： COS1、3、7细胞、293T细胞大量表达SV40 T抗原，激活SV40复制起始点，引发DNA复制，拷贝数可达105/细胞，瞬时高水平表达，对细胞有毒性。 2．增强子/启动子： SV40、CMV、MT增强子/启动子，有效高水平转录 3．内含子： 既可插cDNA，也可插基因组，但不能太大 4. 终止子： 真核生物的转录终止信号和终止机制不很清楚 使用病毒基因转录终止子、polyA位点 5．侧翼区结构： Kozak规律序列(真核核糖体结合位点) ： 翻译起始部位的序列，有效进行翻译的必要条件： GCCGCC（A/G -3）CCA1UGG+4 -3位嘌呤，其它邻近序列不同影响轻微 -3位不是嘌呤时，+4位要为G，其它邻近序列尽量相同 先导序列长度（ AUG-5’ 之间的长度）：17-80bp，过短会划过第一个AUG，从第二个AUG开始翻译 5’UTR：发卡式二级结构会阻止核糖体位