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第35课时　基因工程 考点一　核心概念——基因工程的概念及工具 1．基因工程的概念理解 (1)操作环境：体外——关键步骤“基因表达载体的构建”的环境。 (2)优点 ①与杂交育种相比：克服了远源杂交不亲和的障碍。 ②与诱变育种相比：定向改造生物遗传性状。 (3)操作水平：分子水平。 (4)原理：基因重组。 (5)本质：甲(供体：提供目的基因)乙(受体：表达目的基因)，即基因未变，合成蛋白质未变，只是合成场所的转移。 2．基因工程的基本原理和理论基础概括如下图 提醒　若题目强调“目的基因”的表达过程，则只包括“转录和翻译”两个过程，不包括目的基因的复制。 3．操作工具 (1)限制性核酸内切酶——“分子手术刀” ①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 ②化学本质：蛋白质。 ④作用特点：特异性，即限制性核酸内切酶可识别特定的脱氧核苷酸序列，切割特定位点。 ⑤切割方式 提醒　①切割的化学键为磷酸二酯键。 ②在切割目的基因和载体时要求用同一种限制性核酸内切酶，目的是产生相同的黏性末端。 ③将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端。 ④不同DNA分子用同一种限制性核酸内切酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制性核酸内切酶切割，产生的黏性末端一般不相同。 (2)DNA连接酶——“分子缝合针” 常用类型 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 功能 连接黏性末端 连接黏性末端或平口末端 结果 恢复被限制性核酸内切酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 拓展提升　DNA连接酶与DNA聚合酶的比较 DNA连接酶 DNA聚合酶 作用实质 都是催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键 是否需要模板 不需要 需要 连接DNA链 双链 单链 作用过程 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3′端的羟基上，形成磷酸二酯键 作用结果 将两个DNA片段连接成重组DNA分子 合成新的DNA分子 (3)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” ①类型 ②功能：将目的基因导入受体细胞。 ③应具备条件 a．能在宿主细胞内稳定保存并大量复制；b.有一个至多个限制性核酸内切酶的切割位点，以便于与外源基因连接；c.有特殊的遗传标记基因，供重组DNA的检测和鉴定。 提醒　①一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的载体进行人工改造。 ②常见的标记基因有抗生素抗性基因、产生特定颜色的表达产物基因、发光基因等。 ③作为载体必须具有一个至多个限制性核酸内切酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个。因为某种限制性核酸内切酶只能识别单一切点，若载体上有一个以上的酶切点，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则进入受体细胞后便不能自主复制。一个载体若只有某种限制性核酸内切酶的一个切点，则酶切后既能把环打开接纳外源DNA片段，又不会丢失自己的片段。 ④注意与细胞膜上载体的区别，两者的化学本质和作用都不相同。 ⑤质粒能自我复制，既可在自身细胞、受体细胞内，也可在体外。 1．(2010·浙江卷，2)在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，如下操作错误的是(　　) A．用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸 B．用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体 C．将重组DNA分子导入烟草原生质体 D．用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞 考点二　以流程图解决知识内在联系——基因工程的操作步骤 　基因工程的基本操作步骤 1．获得目的基因 (1)如果目的基因的序列是已知的，可用化学方法合成目的基因，或者用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因。 (2)如果目的基因的核苷酸序列是未知的，可以从基因文库中获取。 2．制备重组DNA分子 (1)重组DNA分子的结构：启动子、目的基因、终止子以及标记基因等。 提醒　①与载体相比较，增加启动子、目的基因和终止子三个基因片段，其功能各不相同。 ②启动子(DNA片段)≠起始密码子(RNA)；终止子(DNA片段)≠终止密码子(RNA)。 (2)重组DNA分子的制备方法： 3．转化受体细胞 (1)含义：将重组DNA分子导入受体细胞的过程。 (2)受体细胞的类型：植物细胞、动物细胞、微生物细胞。 (3)转化方法因受体细胞不同而异 ①动物细胞的转化技术 ②植物细胞的转化技术 4．筛选重组细胞 (1)筛选的原因：不是所有的受体细胞接纳了重组DNA分子，只有部分受体细胞中含有目的基因。 (2)筛选的方法：插入灭活法。 5．实现功能表达：培养受体细胞并诱导目的基因的表达。 6．实例：抗软化番茄的培育过程 (1)目的基因：抗多聚半乳糖醛酸酶基因 (2