益生元因可增加肠道益生菌的种群数量.docVIP

益生元因可增加肠道益生菌的种群数量，并可有效改善机体健康状态而备受学者的关注。已有大量研究表明非消化性的低聚糖具有良好的益生元作用，且性质稳定、安全无毒。因此开发新型功能性益生元，是益生元研究和工业化发展的重要方向。本文拟以人参多糖益生菌菌株为研究对象，对人参多糖的潜在益生元活性及合生元的功能性进行评价。 利用气相色谱检测了不同菌株发酵液中乳酸和短链脂肪酸的含量，结果表明不同菌株所产生的主要短链脂肪酸均为醋酸，含量由0.55到1.18mg/mL，且菌株C88总短链脂肪酸产量均高于其它菌株。利用DPPH自由基、ABTS自由基、超氧阴离子自由基清除实验及铁离子螯合实验评价人参多糖与植物乳杆菌C88联合使用的体外抗氧化活性，结果表明人参中性多糖与人参酸性多糖分别与植物乳杆菌C88联合使用均具有明显的抗氧化活性，且酸性多糖活性高于中性多糖。另外，以自然衰老小鼠作为动物模型，通过体内试验检测人参酸性多糖联合植物乳杆菌C88的体内抗氧化活性，结果表明联合用药可抑制衰老小鼠血清及肝组织中中丙二醛 (MDA) 的形成，提高超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)活性及总抗氧化能力(T-AOC)。 研究结果表明人参酸性多糖联合益生菌C88可明显增强免疫抑制小鼠吞噬细胞的吞噬能力及迟发型超敏反应结果，小鼠血清白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）、干扰素-γ（INF-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α），免疫球蛋白-g（IgG）含量明显升高，白细胞介素-10含量明显下降，并且均具有一定的剂量依赖性，同时联合用药组的作用效果要明显强于酸性多糖单独用药组。 称取干燥人参根粉末200g，按1:10比例加入蒸馏水浸泡过夜，100℃提取两次，每次2小时，合并提取液并过滤（6层纱布），浓缩滤液至800mL，加入3倍量无水乙醇醇沉，过夜（4℃）。收集沉淀，加尽量少蒸馏水充分溶解，离心（20min，3800rpm，4℃），收集上清液，重复3次后，硫酸-苯酚法显色检测基本无多糖，合并上清液，于-80℃冷冻后干燥，得粗人参多糖(WGP)。 1.2.1.2人参粗多糖分离纯化 称取上述制备的人参总多糖加水溶解，离心，取上清，重复3次，合并上清液，弃沉淀，利用 DEAE-纤维素离子交换层析柱，分别以蒸馏水和0.5MNacl为洗脱剂。上样后，首先以蒸馏水进行洗脱，后以 NaCl 溶液（0.5 M）进行洗脱。洗脱液利用自动部分收集器收集，合并含多糖的洗脱液部分（检测方法：硫酸-苯酚显色法），透析（透析袋分子量3500Da）2-3天后于-80℃冷冻干燥，分别得中性多糖(WGPN)及酸性多糖(WGPA)，收集备用。 1.2.2 人参多糖益生元活性评价 1.2.2.1菌株来源及培养基 菌株来源：菌株“C”分离于内蒙古奶豆腐，菌株“S”分离于东北传统发酵酸菜。上述菌株均已通过API50 CHL试剂盒及16S rDNA序列分析鉴定为植物乳杆菌。 配制含人参多糖的SDM培养基时除添加葡萄糖外，其它均同。分别以葡萄糖、人参酸性多糖、人参中性多糖为碳源，配制相同浓度（2g/L）的SDM培养基。 1.2.2.2 人参多糖对植物乳杆菌益生元活性测定 菌株分别用上述培养基进行培养，初步筛选出生长状况相对良好的菌株并测定菌株生长曲线。生长曲线测定方法：无菌操作条件下，将已配制的含不同人参多糖或葡萄糖的SDM培养液分装于无菌10mLEP管中，每管3mL，按3%接菌量，于37℃培养箱培养，于培养0、4、8、12、16、20小时时测定OD600值。 分别将不同时间段培养液取出后离心（4000rpm，5min，4℃）得菌泥，加入等体积的生理盐水（0.85%NaCl，3ml），充分混匀后，利用紫外-分光光度计于600nm测定OD值，记录不同菌株的生长情况，筛选出菌株生长趋势最为明显的菌株。 1.2.3短链脂肪酸分析测定 短链脂肪酸的测定根据Schneider等[59]的描述，利用气相色谱进行测定。分别用人参酸性多糖SDM培养基及人参中性多糖SDM培养基培养上述已筛选菌株，每株4ml按3%接菌量，37℃厌氧培养20h后，取2mL培养液至已灭菌的10mLEP管中，加入0.5mL质量分数为2%的硫酸铜溶液杀死菌株。取2mL上述含硫酸铜的培养液于EP管加入0.4mL质量分数50%的硫酸和2mL乙醚混匀，于摇床250r/min振荡摇匀45min，后离心（3000r/min，5min），取上清液于另一无菌EP管中，加入无水氯化钙脱水，取上清液利用气相色谱测定甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸及乳酸的质量浓度。 短链脂肪酸测定采用外标法，用乙酸、丙酸、正丁酸、异戊酸和乳酸做标准曲线，检测器为氢火焰检测器（FID）；色谱条件为载气N2，分流比10:1，流速2.0mL