第动物细胞融合和杂交瘤技术.ppt

13.1 动物细胞融合技术 １９５７年，日本学者冈田善雄在培养动物细胞时加入失去活性的仙台病毒，发现能使两个动物细胞融合，产生具有两个核的细胞。研究表明，很多不同种的动物细胞都能进行融合，形成杂种细胞。如人－鼠、人－兔、人－鸡、人－蛙、鼠－鸡、鼠－兔、鼠－猴等等。 几个概念 　通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交（cell hybridization）。 　　基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体（homokaryon）；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon）。 　　同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合，称诱发融合。 细胞融合的具体步骤包括： 　　（１）细胞准备。分贴壁和悬浮细胞两种。前者可直接将两亲本细胞混合培养，后者需制成一定浓度的细胞悬浮液。 　　（２）细胞融合，加促融因子于将行融合的细胞之中，诱导融合。 　　（３）杂种细胞选择。利用选择性培养基等，使亲本细胞死亡，而让杂种细胞存活。 　　（４）杂种细胞克隆。对选出的杂种细胞进行克隆（选择与纯化），经过培养，就能获得所需要的无性繁殖系。 诱导细胞融合的方法 　诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（离心，震动，电刺激）。 某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusion protein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。 化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。 　 免疫反应是人类对疾病具有抵抗力的重要因素。当动物体受抗原刺激后可产生抗体。抗体的特异性取决于抗原分子的决定簇，各种抗原分子具有很多抗原决定簇，因此，免疫动物所产生的抗体实为多种抗体的混合物。用这种传统方法制备抗体效率低、产量有限，且动物抗体注入人体可产生严重的过敏反应。此外，要把这些不同的抗体分开也极困难。 要制备单克隆抗体需先获得能分泌单克隆抗体的B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外无限生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的B淋巴细胞二者合二为一，再在特定的选择性培养基中筛选出杂交瘤细胞。这种杂交瘤细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞分泌专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 筛选过程一般分为两步进行：一是融合细胞的抗体筛选，二是在此基础上进行的特异性抗体筛选。将融合的细胞进行充分稀释，使分配到培养板的每一孔中的细胞数在0至数个细胞之间（30％的孔为0才能保证每个孔中是单个细胞），培养后取上清以ELISA法选出抗体高分泌性的细胞；这一过程常被习惯地称作克隆化。 具体的操作步骤包括: (一)细胞的选择与培养 (二)细胞融合试验 (三)单克隆抗体检测 (四)克隆化培养 (五)杂交瘤细胞的鉴定 (六)单克隆抗体的大量制备 (七)单克隆抗体的鉴定 （八）单克隆抗体的纯化 作为亲合层析的配体用于产品的分离纯化； 作为生物治疗的导向武器开发靶向治疗药物； 作为免疫抑制剂治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应； 作为研究工作中的探针从分子、细胞和器官的不同水平上研究抗原物质的结构与功能的关系； 增强抗原的免疫原性研制抗原—抗体复合物型治疗性疫苗； 作为医学检验试剂诊断各类病原体、用于肿瘤的诊断、分型及定位、检测淋巴细胞表面标志、测定机体微量成分。 作 业 1、比较植物体细胞杂交和动物细胞融合的异同。 2、制备单克隆抗体时，为什么要选用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？ 3、杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要步骤。 4、请举例说明单克隆抗体的应用。 应用 １.可用于作为诊断试剂：有准确，高效，快速的优点 ２.可用于疾病治疗 ３.可用于运载药物（作为运载对应疾病的药物的 “生物导弹“。） “生物导弹”＝单克隆抗体＋药物 4.可用于亲和层析分离纯化技术。  1.植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么不同？ 提示：植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相同，不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，然后再融合；动物细胞融合是两个体细胞直接融合。 植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较(两项技术都有细胞融合过程) 2.制备单克隆抗体时，为什么要选用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？ 提示：哺乳动物感