western-blot原理及操作流程1116讲述.pptVIP

杂交需要试剂－底物 显色底物：操作简单，灵敏度低，如TMB、DAB、BCIP/NBT 化学发光底物：灵敏度高，需要曝光检测设备（暗室、曝光设备和胶片）或者凝胶成像设备。 结果分析 使用Photoshop 检测灰度值 使用graphpad做柱状图 WB常见问题 没有信号 高背景 非特异性条带 条带大小不对 标本问题 标本中不含检测蛋白：设置阳性对照 上样量不够，或者蛋白表达丰度比较低：增加上样量 转膜问题 转膜不完全：转膜后使用丽春红染色，确定目的大小蛋白条带是否存在于膜上，使用蛋白质Marker. 洗涤过度：减少洗涤时间和次数. 封闭 封闭过度：减少封闭试剂浓度，封闭时间，更换封闭试剂 抗体孵育和检测 抗体浓度和时间孵育不够：增加抗体浓度，延长孵育时间 一抗不工作：设置阳性对照 二抗不工作：和其他一抗配合检测二抗是否工作 一抗/二抗不匹配：检查抗体的来源和亚型。正确选择二抗 底物失活：重新配制有效的底物 没有信号/弱信号 背景高 封闭 封闭时间不够：延长封闭时间 优化封闭试剂的类型和浓度 封闭试剂和抗体有交叉反应：更换封闭试剂. 磷酸化抗体不能使用含有酪蛋白的封闭试剂：推荐BSA封闭 抗体孵育和检测 一抗/二抗浓度太高：降低抗体浓度 孵育温度太高：建议4度孵育过夜 其他 洗膜不充分：5*3mins，多次短时间的洗膜 曝光时间过长：缩短曝光时间 出现干膜现象：保证膜