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乙型肝炎病毒（HBV）PCR检测与临床应用 　　【摘要关键词】乙型肝炎；病毒；检测 　　【中图分类号】R440 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2012）12-0307-02 　　1 HBV概述 　　根据2004年全国HBV感染的血清流行病学调查： 　　1.1 一般人群HBsAg阳性率为9.09%（95年为9.75%） 　　接种过乙肝疫苗的人群HBsAg阳性率为4.51% 　　未接种过乙肝疫苗的人群HBsAg阳性率为9.51% 　　1.2 慢性乙型肝炎患者约为2000 - 3000万人 　　1.3 乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一种世界性疾病。发展中国家发病率高，据统计，全世界无症状乙肝病毒携带者（HBsAg携带者）超过2.8亿，我国约占9300万。多数无症状，其中1/3出现肝损害的临床表现。目前我国有乙肝患者3000万。乙肝的特点为起病较缓，以亚临床型及慢性型较常见。无黄疸型HBsAg持续阳性者易慢性化。本病主要通过血液、母婴和性接触进行传播。乙肝疫苗的应用是预防和控制乙型肝炎的根本措施。 　　1.4 乙型肝炎病毒（HBV）为专一的嗜肝病毒，近年由于核酸分子杂交技术的进展，在肝外器官细胞也能检出HBV-DNA。通过北京鸭乙肝肝病毒试验研究提供了在肝外细胞复制的证据。人HBV也可能在肝外细胞内复制，有待深入研究。HBV感染者血清经电镜检查有3种病毒颗粒：①Dane颗粒（HBV颗粒），外壳蛋白为HBsAg，核心含有HBV-DNA及HBVDNAp（DNA-多聚酶）、HBcAg、HBeAg；②小球形颗粒；③管形颗粒。后二者为HBV复制过程中过剩的病毒外壳（HBsAg），不含核酸。 　　1.5 HBV基因组（HBV-DNA）由双链不完全环形结构的DNA组成，含3200个核苷酸。由于其宿主范围较小，体外细胞培养分离病毒尚未成功。近年随着分子克隆技术的应用及体外培养细胞系转染的成功，对HBV复制过程有了进一步的了解。HBV-DNA分为负链（长链）及正链（短链）所组成。其负链有4个开放读码框架（Open Reading Frame，ORF）：①S基因区，由S基因，前S2（pre-S2）基因、前S1（pre-S1）基因组成。分别编码HBsAg，pre-S、pre-S1及多聚人血清白蛋白受体（PHSA-R）；②C基因区，由前C基因和C基因组成。分别编码HBeAg及HBcAg；③P基因区，编码HBV-DNAp，并具有逆转录酶活性；④X基因区，编码HBxAg，并具有激活HBcAg基因的作用。 　　1.6 HBV复制过程 HBV基因组虽为双链环形DNA，但其复制过程有RNA逆转录病毒的特性，需要逆转录酶活性产生RNA/DNA中间体，再继续进行复制。其过程为：①在由病毒和/或细胞来源的DNA-p作用下，正链首先延伸形成共价闭合环状DNA（Covalently Closed Circular DNA）。②以此为模板，通过宿主肝细胞酶的作用转录成复制中间体。③再以此为模板，通过逆转录酶的作用，形成第一代和第二代DNA。此双链DNA部分环化，即完成HBV-DNA的复制。 　　2 检测方法 　　2.1 HBV-DNA定量检测 　　2.1.1 核酸直接检测法：bDNA检测技术、微孔板酶标杂交检测法。 　　2.1.2 PCR 定量检测法：FQ-PCR 和 ELISA-PCR。比如：实时荧光定量PCR的原理。实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 　　本技术的原理是使用荧光基团标记探针，5′端标记荧光基团R，3′端标记淬灭基团Q，在没有PCR扩增时，由于荧光基团和淬灭基团空间距离很近，使荧光基团被淬灭，不发荧光；而当PCR扩增时，引物与荧光标记的特异性探针同时结合在模板上，荧光标记的探针与模板的结合位置位于上下游引物之间，利用Taq酶的5′ 3′外切酶活性，将荧光探针水解，荧光基团被释放出来，由于在空间上与淬灭基团分开，则发出荧光。发出的荧光可以被荧光探头检测到，一边扩增，一边检测，这样就实现了“实时”检测。该技术不仅实现了PCR从半定量到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性强、自动化程度高、有效解决了PCR污染问题等特点。 　　3 结果的报告 　　3.1阴性：最低检测灵敏度 拷贝/ml如：（500拷贝/ml）。 　　3.2阳性：具体数据拷贝/ml （如：5.0E+6拷贝/ml ）。 　　参考值：最低检测灵敏度 拷贝/ml。 　　3.3 HBV-DNA定量检测存在的问题：假阳性问题、假阴性问题、结果稳定性问题。 　　3.4假阳性问题：主要原因：污染、质粒、PCR扩增产物、标本及核酸提取物。 　　措施：UNG（尿