孕母外周血中胎儿游离DNA的检测在产前诊断唐氏综合征的应用.docVIP

孕母外周血中胎儿游离DNA的检测在产前诊断唐氏综合征的应用 　　[摘要] 目的 探索从孕妇外周血浆中检测胎儿游离DNA （ cffDNA ）在产前诊断唐氏综合征中的价值。方法 选择定期产前检查2 800例孕妇中唐氏筛查结果高风险的孕妇96例，抽羊水检查前抽孕母血提取胎儿游离DNA，然后进行PCR得到测序用的文库，在Hiseq2000的平台上进行测序，对测序的数据进行统计学分析，得出胎儿患病风险。其结果与羊水检查的胎儿染色体核型结果对照。结果 96例唐氏筛查高风险的孕妇中，3例高风险，高风险率为3/96=3.125%，3例高风险孕妇与羊穿结果符合率100%。结论 该检测方法准确度高，96.875%唐氏筛查高风险的孕妇可以通过该检测方法被排除，避免了这些孕妇进行羊水穿刺的风险。 　　[关键词] 胎儿游离DNA；唐氏综合征；PCR；测序 　　[中图分类号] R714 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2013）04（b）-0188-02 　　为了探讨从孕母外周血浆中检测胎儿游离DNA（cffDNA）在产前诊断唐氏综合征中的价值，选择2012年1月―2012年10月定期产前检查唐氏筛查的孕妇2 800例进行分析研究，现报道如下。 　　1 对象与方法 　　1.1 对象 　　选择2012年1月-2012年10月在郑州市第一人民医院定期产前检查做唐氏筛查的孕妇2800例，其中唐氏筛查的高风险孕妇96例，抽羊水检查前抽孕母血提取胎儿游离DNA，然后进行PCR得到测序用的文库，在Hiseq2000的平台上进行测序，对测序的数据进行统计学分析，得出胎儿患病风险。孕妇平均年龄（30±3）岁， 平均孕周（17±2）周；均为单胎；孕妇均无妊娠合并症。分别签定知情同意书，并将实验结果与其染色体核型进行核实对照 。 　　1.2 方法 　　①取母体血液，制备血浆。血液样品经高速离心后得到除去了血细胞的血浆样品，每个样品的血浆量大约为1 mL。②提取血浆DNA 使用Qiagen公司生产的DNA抽提试剂盒来提取血浆中的DNA。③将血浆DNA制成可供双端测序的文库。将提取的DNA末端补平并进行5端磷酸化：将DNA30 μL、 纯水45 μL、具有10 mM ATP的T4DNA连接酶缓冲液10 μL、10 mM dNTP Mix 4 μL、T4DNA聚合酶5 μL、Klenow酶1 μL、T4PNK 5 μl混合后，在20℃温浴30 min（试剂为Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001 提供）。温浴后采用 QIAGEN QIAquick PCR 纯化试剂盒（part#28104）纯化DNA。将上步的产物溶解在32 μl缓冲液中，加入Klenow缓冲液5 μL、1 mM dATP 10 μL、Klenow Exo-3 μL，在37 ℃保持30 min（试剂为Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001提供），产物由QIAGEN MinElute PCR纯化试剂盒（part#28004）连接：DNA溶解在10 μL缓冲液中，加入DNA连接酶缓冲液 2x 25 μL、PE Adapter Oligo Mix10 μL，DNA连接酶5 μL，在20 ℃保持15 min（试剂为Illumina 样本准备试剂盒E-102-1001提供）。温浴后采用QIAGEN QIAquick PCR纯化试剂part#28104）纯化DNA。④对DNA双端测序文库的双端短序列进行测序。用Illumina的cBot仪器将DNA双端测序文库中单一的DNA分子制成DNA簇，将生成的DNA簇珠在HiSeq2000 测序仪进行双端测序。此过程均由仪器本身自动完成。⑤确定血浆中的DNA片段来自几号染色体，并确定待测染色体的拷贝数是否正常。在进行了DNA文库的双端测序后，当已知了一个DNA片段两端各90bp的碱基序列后，可以将这两端的序列与人类基因组标准序列比对，该数据库也称 hg19，确定了这两端的序列分别在染色体上的位置，该两端序列之间的距离就是该 DNA片段的长度， 同时该两端序列所在的染色体位置即确定了该DNA片段来自几号染色体。⑥取DNA的序列长度在100～250 bp之间的任意一点或任意一个区间的所有DNA的比对结果，计算并确定待测染色体的拷贝数。 　　2 结果 　　2008例孕妇唐氏筛查高风险96例，高风险率为96/2800，占3.43%，96例唐氏筛查高风险的孕妇中，通过孕母血中胎儿游离DNA的检测得出高风险率为3/96=3.125%，3例高风险孕妇羊穿结果证实为21-三体，与羊穿结果符合率为100%。也就是说有96.875%的唐氏筛查高风险的孕妇可以通过该检测方法被排除。避免了这些孕妇再次进行羊水穿刺的风险。更容易被孕