做原核表达的教训和体会..docVIP

最近在做原核表达，包涵体。以前也做过，但经验不多。从园子里也学到不少。一点失败的教训以及纯化过程中的体会，贴出来与大家共享，同时希望得到同行们的指正。 1. 首先介绍一下背景。载体是novagen公司的pET22b，Amp抗性。菌株是Invitrogen的BL21 star DE3，是一个蛋白降解酶突变菌株，也就是说是一种优化表达菌株。 2. 第一次失败。第一次做诱导的时候，重复了很多次，但总是诱导不出来。PCR、酶切都正确。但没等测序结果出来就开始做了。失败了，曾在园子求助。后来证明是引物错误。我们实验室合成引物都要先发给purchasing office，然后才由他们与公司交涉。这个office的老太太把引物弄掉了一个碱基。教训：在实验过程中，再仔细都是不为过的。引物来了后管壁上贴有序列，但我忽略了。 3. 第二次失败。后来重新构建、转化、诱导。第一次诱导时根本就没带。见附图（图片质量太差了，下面几个帖会逐渐好转） 然后开始闷头找原因。周一下午5点我就接了DE3菌，由于那天人非常不舒服，去看医生了，等了很久，到第二天中午11点才转接！而且是按1:50转接的！也就是菌在转接之前培养了18 h！ 我们都知道，带Amp的E.coli在含Amp的平板上培养超过16 h后，菌周围会长出小菌落，我们叫它卫星菌落。这是因为细菌在生长的时候，为了抵抗Amp，会分泌B－内酰胺酶，而