《PCR实验室检测技术.pptVIP

PCR实验室检测技术 宁夏动物疾病预防控制中心 2011.08.04 PCR检测技术 一、 PCR技术原理 DNA在细胞中的复制是—个比较复杂的过程。参与复制的基本因素有：DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA模板、由引发酶合成的RNA引物、核苷酸原料、无机离子、合适的pH、以及解开DNA的超螺旋及双螺旋等结构的若干酶与蛋白质因子等。　 　 PCR是在试管中进行DNA复制反应，基本原理与体内相似，不同之处是耐热的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加热(变性)、冷却(退火)、保温(延伸)等改变温度的办法使DNA得以复制，反复进行变性、退火、延伸循环，就可使DNA无限扩增。将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色，在紫外灯照射下一般都可见到DNA的特异扩增条带。 二、PCR技术工作流程及注意事项 （一）PCR实验室的布局 PCR只需几个DNA分子作模板就可大量扩增，应注意防止反应体系被痕量DNA模板污染和交叉污染，这也是最容易造成假阳性原因之一。实验室布局应重点考虑避免这种污染。因此用于PCR检测的实验室要进行功能区域划分，从对环境要求的严格程度和功能上可将PCR整个实验流程划分为四个区域： 1.配液区（准备区） 2.模板提取区 3.PCR扩增区 4.电泳区 （二）各区操作注意事项 下述操作在该区进行： 储存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。 在本区的实验操作过程中，必须戴手套并经常更换。 操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。 工作结束后必须立即对工作区进行清洁。 实验室及其设备的使用必须有日常记录。 2. 模板制备区 下述操作在该区进行： 标本保存、核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。 为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。 对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。 样本处理对核酸扩增有很大影响，必须使用有效的核酸提取方法。 3. 扩增区 下述操作在该区进行：DNA或RNA扩增。 不能从本区再进入任何“上游”区域，可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。 为避免气溶胶所致的污染，尽量减少在本区的走动。 4.电泳区 下述操作在本区内进行：扩增片段的测定。 本区是最主要的扩增产物污染来源，因此必须注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。 本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、丙稀酰胺、甲醛或同位素等，应注意实验人员的安全防护。 本区如采用负压或减压情况下可减少扩增产物从本区扩散至前面区域的可能性。 （三） PCR实验室设置的原则 注意： 唯一流向制度问题 ：要求物流、人流均应严格遵守1→ 2→ 3→ 4路线，严禁倒流。 物品的专用与移动问题 ：移液器、吸头和离心管等为PCR专用，各区之间勿串用 三、PCR操作程序 一是PCR扩增模板的制备，也就是病原微生物基因组提取 二是PCR扩增，即目的基因特异扩增过程 三是琼脂糖凝胶电泳分析，在紫外灯下检测基因片段 *PCR模板的提取 （一）样品的采集及前处理 活禽，建议取咽喉拭子和泄殖腔拭子：取咽喉拭子时将拭子深入喉头口来回刮几次取咽喉分泌液，取泄殖腔拭子时将拭子深入泻殖腔转一圈沾取粪便。然后将拭子一起放入盛有2ml PBS（含抗菌素）的试管，充分洗涤拭子，然后在管壁挤干液体，转入无菌离心管中备用。 组织脏器，取待检样品0.05g于已洗净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加2ml PBS混匀，取上清转入无菌离心管中备用。 血清、血浆、乳汁、精液或组织渗出液，则直接取用。 （二）提取模板 提取病原微生物基因组是PCR操作成功关键的一步，特别是病原RNA的提取显得非常重要。一般分为两步： 1.裂解病原微生物，使病原基因组从病原体溢出。 2.纯化病原基因组，去除蛋白质和一些盐类。 （三）病原微生物基因组提取注意事项 1.RNA提取应注意RNA酶（RNase）污染问题，RNase是一种不怕热和不易降解的蛋白质，而且广泛存在于我们工作环境中，对于此酶污染的防治办法主要有两方面：①在提取RAN试剂中加入一些RNase 抑制剂② 操作过程中保持环境干净、密闭、戴口罩手套操作等。 2.在病原微生物基因组提取时，由于是微量，几乎看不见。所以当离心机离心沉淀RNA和DNA时要记住离心管方向，加入乙醇洗沉淀时要缓慢加入，避免冲掉已提取出来的模板。溶解沉淀时要沿着沉淀部位进行溶解。 3.在病原微生物基因组提取时，应注意实验室环境污染和操作