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2012年环境分子生物学实验 第一部分：16S rRNA靶向变性梯度凝胶电泳指纹图谱分析微生物菌群 实验原理： 微生物菌群对于地球上甚至地球外的几乎所有环境的发展和功能是至关重要的，而针对一系列细胞生物标记物的分子微生物生态学方法的长足发展，使得对微生物群落组成和功能的监测可以不依赖于微生物的培养。过去几十年中，利用所谓的生物标记物来监测环境样本中的微生物菌群的分子微生物生态学（molecular microbial ecology）得到了快速发展。许多分子可以作为生物标记物，包括细胞壁成分、蛋白质、脂类、DNA或RNA。尤其是核糖体RNA（rRNA）小亚基（细菌和古细菌的16S rRNA，真核生物的18S rRNA）和相应基因的应用在微生物生态学的发展中发挥了重要的作用。以这些分子作为靶点，可以利用很多互为补充的分子技术来监测不同环境下总的细菌、古细菌和真核生物群落，以及特定的感兴趣的微生物种类。 目前多以核糖体RNA小亚基基因检测作为普遍的系统发育标记物的分子指纹图谱方法，常被用于在分子微生物生态学中快速检测不同时间或空间中微生物群落组分的变化。结合数理统计分析，这些技术是研究不断变化的环境因子如何影响微生物群落构成的有力工具。目前已经建立了几种应用于环境样本中的微生物群落的指纹特征分析方法。其中最常用的方法是PCR扩增片段的变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）。DGGE可以根据序列将相同长度的DNA片段混合物分开。分离的原理是基于DNA片段在含有梯度变性化合物（通常是尿素和甲酰胺的混合物）配制的聚丙烯酰胺凝胶中的序列特异性熔点不同实现的。在5’端引入GC夹（GC-clamp）可以保护DNA片段不会完全变性。这个GC夹有30~50bp长，是在进行DGGE分析之前加到对靶基因进行PCR扩增的一个引物上的。DGGE能对微生物群落进行快速的分析和比较。利用DGGE可使组成的多样性一目了然，不同序列的片段将停留在不同的位置，其中每一条带原则上代表一种细菌系群。染色后，在凝胶中DNA分子停止迁移的位置会看到条带。理论上，DGGE指纹图谱可以区分不长于500bp的PCR扩增产物上的一个碱基对的差别。该技术在快速比较不同环境中的微生物群落和监测某一特定的群落在不同时间的组成变化中非常有效。 实验步骤： 地表水细菌基因组DNA提取 裂解液：0.05 M Tris-HCl（pH 8.0），0.1 M NaCl，0.1 M EDTA（pH 8.0），1% SDS。 Tris饱和酚：用1M Tris-HCl（pH 8.0）饱和的新鲜苯酚，含0.1%的8-羟基喹啉，pH＞7.8。 酚/氯仿/异戊醇：Tris饱和酚中加入氯仿和异戊醇，体积比为25:24:1。 无水乙醇和70%乙醇 TE：0.01M Tris-HCl，0.001M EDTA，pH8.0。 1×TAE电泳缓冲液：0.04 M Tris，0.02 M HAc，0.05 M EDTA，pH 8.0。 0.5×TBE电泳缓冲液 （1）取1.5mL×6地表水样4000r/min离心10min，弃上清，加入500 μL裂解液充分悬浮。 （2）加入500μL Tris饱和酚，混匀，室温放置10min，4000r/min离心10min。 （3）吸取上层水相转移至新离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，颠倒混匀后4000r/min离心10min。（若有必要，可重复操作一次。） （4）吸取上层水相转移至新离心管，加入两倍体积无水乙醇，充分沉淀后10000r/min离心10min，弃去上清液。 （5）加入1mL 70%乙醇，充分悬浮后10000r/min离心10min，弃去上清液，晾干10min。加入50μL TE溶解，得到细菌基因组DNA。 （6）取10μL 样品进行电泳检查（Marker为λ DNA/HindⅢ酶切），剩余样品-20℃保存。 细菌16S rRNA基因V3区扩增 取2.0 μL 基因组DNA作为PCR模板，按照下表顺序和体积将反应液加入0.5mL的薄壁PCR管中，总体积50μL。 引物1： 5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’ 引物2： 5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’ 表： 试剂 体积(μL) 终浓度 模板 2.0 -- 引物1 (10 μM) 1.0 0.2 μM 引物2 (10 μM) 1.0 0.2 μM 10×PCR Buffer （含Mg2+） 5.0 1× 10 mM dNTPs 1.0 0.2 mM Taq聚合酶 1.0 2 U dd H2O 39.0 -- 总体积