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浮游植物叶绿素a4种提取方法的比较 　　【摘要】 目的 优选地表水中浮游植物叶绿素a的提取方法。方法实验室制备发生水华的水样， 分别选用丙酮研磨法、冻融法、丙酮加热法、混合溶剂法4种方法提取叶绿素a， 进行叶绿素a含量的测定。结果 冻融法、丙酮加热法、混合溶剂法对样品中叶绿素a的提取效果及方法精密度优于丙酮研磨法（P0.05）。结论 丙酮加热法和混和溶剂法可为常用叶绿素a测量方法， 尤其适用于大批量水环境样品的测定。 　　【关键词】 叶绿素a；提取；丙酮研磨法；混和溶剂法 　　叶绿素a（chlorophyll a）存在于所有植物中， 是估算水体中浮游植物浓度的重要指标。近年来， 由于中国水体富营养化问题日益严重， 浮游植物叶绿素a的测定备受关注。浮游植物叶绿素的测定方法根据测定仪器可分为高效液相色谱法（HPLC法）、荧光光度计法和分光光度计法等， 但上述方法均不适用于快速、大量、野外样品的分析。目前国内浮游植物叶绿素a的常规测定方法存在测定结果偏低、耗时长、重复测定精密度差等特点， 且在研磨过程中操作人员和丙酮接触时间长， 不利于实验人员的健康。因此， 人们通过改变细胞破碎方式、延长提取时间、增高提取液温度、改变提取溶剂等方法， 对标准方法进行了优化改进。 　　本文选取丙酮研磨法、冻融法、丙酮加热法、混合溶剂提取法， 以实验室培养的水华水样为实验对象， 进行叶绿素a 的测定研究。从叶绿素a的提取效果、重复操作精密度、操作的简便性和叶绿素a在提取溶剂中的稳定性等几个方面对这4种测定方法进行比较， 报告如下。 　　1 材料与方法 　　1. 1 水样准备 将实验室培养的藻种混合配置成实验水样， 水样中含有硅藻属中的小环藻和菱形藻， 绿藻属中的小球藻、栅藻、新月藻。水样配好后立即加入碳酸镁， 每升样品加1%的碳酸镁1 ml， 以防止酸化引起的色素波长偏移。在抽滤器上装好乙酸纤维滤膜， 将水样摇匀后分成20份， 每份250 ml， 分别抽滤浓缩， 抽完后继续抽1～2 min， 以减少滤膜上的水分。将滤膜对折后， 夹在滤纸内， 套上黑塑料套， 于-20℃条件下干燥过夜。 　　1. 2 叶绿素a的提取 　　1. 2. 1 丙酮研磨法 将冰冻过夜的滤膜取出剪碎放入研钵， 加入少量碳酸镁粉末和90%丙酮10 ml充分研磨（6ml用于研磨， 4 ml用于润洗）， 将样品转移至10 ml具塞离心管中， 在4℃冰箱中避光浸提8～10 h。 　　1. 2. 2 丙酮加热法 将90%丙酮在控温水浴锅中预热（55℃）。将冰冻过夜的滤膜取出剪碎放入10ml具塞离心管中， 加入上述预热的丙酮10 ml， 在55℃条件下水浴2 min， 于4℃冰箱中避光浸提2 h。 　　1. 2. 3 冻融法 将过夜的滤膜取出剪碎放入10 ml具塞离心管中， 再放入-20℃冰箱中冷冻， 每隔30 min 取出在室温中解冻10 min， 反复冻融3～5次后， 离心管中加90%丙酮10ml， 振摇1～2 min后放入4℃冰箱避光浸提， 每隔30 min取出振摇1次， 重复3次。在4℃冰箱中避光浸提20 h。 　　1. 2. 4 混合溶剂法 将过夜的滤膜取出剪碎放入10 ml具塞离心管中， 加入混合提取液10 ml（90%丙酮∶95%乙醇=2∶1；）在4℃冰箱中避光浸提8～10 h。 　　1. 3 比色测定 浸提后将样品3 500 r/min离心15 min， 取上清液上分光光度计测定， 分别以提取溶剂作为空白， 用1 cm光程的比色皿， 读取750 nm、630 nm、663 nm和645 nm下的吸光度。 　　2 结果 　　2. 1 4种方法叶绿素a提取效果的比较 见表1。 　　2. 2 叶绿素a在不同提取液中稳定性的比较见表2。丙酮研磨法、冻融法、丙酮加热法的提取液均为90%丙酮， 混合溶剂法的提取液为90%丙酮+95%乙醇。浸提液在4℃冰箱中避光放置0、3天后测定样品中叶绿素a含量， 用来检验叶绿素a在不同提取液中的稳定性。 　　3 讨论 　　从提取效果和方法精密度来看：冻融法、丙酮加热法、混合溶剂法测定叶绿素a含量结果及重复测定精密度均高于丙酮研磨法，前3者测定叶绿素a含量结果及重复测定精密度间差异无统计学意义。冻融法的提取效率在四种提取方法中最高， 丙酮加热法的精密度较好。 　　从操作耗时来看， 丙酮加热法提取过程操作简单、耗时短， 平均仅需2.5h， 能够满足大量样品快速测定的要求。混和溶剂法和丙酮研磨法实验耗时相近， 均为9h左右。冻融法耗时太长， 需23h， 无法满足快速大量测定的要求。冻融法对藻类叶绿素的提取通过两方面来完成， 一是滤膜在-20 ℃下冰冻， 再在室温条件下融解， 利用细胞内冰粒的形成和细胞液浓度的增高引起