胰岛素氨基酸序列的测定.pptxVIP

桑格法测定氨基酸顺序桑格试剂2,4-二硝基氟苯（DNFB）＋＋DNFB与氨基结合牢固，不易被水解，因此当DNFB-多肽被酸完全水解以后，原来的N-端氨基酸成为黄色的DNFB-氨基酸。然后通过纸层析法与标准样品比较，便可知道N端氨基酸的种类。基本步骤首先让FDNB与胰岛素反应，再用盐酸完全水解胰岛素以后，两种氨基酸被FDNB标记：甘氨酸和苯丙氨酸。由此推测出胰岛素是由两条肽构成。通过其他分析方法，测出了A链由21个氨基酸组成，N-氨基酸为甘氨酸；B链由30个氨基酸组成，N-氨基酸为苯丙氨酸。上面的方法只能知道肽链N-氨基酸的种类。后面通过氨基酸的DNFB标记和盐酸的不完全水解，来继续研究肽链的氨基酸序列：一条肽链被DNFB标记后，盐酸处理肽链，使其变成长度不等的各种短肽。通过电泳等方法使带有标记的不同长度被标记的肽链分离开来，并分别对分离出的各种短肽做组分分析。如果只有一种氨基酸A，那么就是N-氨基酸为A；如果有两种氨基酸A、B，那么肽链就为A-B，如果有三种氨基酸A、B、C，那么肽链就为A-B-C；如果有四种氨基酸A、B、C、D，那么肽链就为A-B-C-D…以此类推。用此方法，桑格得出了胰岛素A链的氨基端排列顺序为Gly-Ileu-Val-Glu-Glu，B链的氨基端排列顺序是Phe-Val-Asp-Glu。DNFB-DNFBDNFB-DNFB-DNFB-DNFB-DNFB-上面的方法虽然能测出肽链一定的顺序，但是只能测定很短的一段。于是再次改变方法，先用盐酸处理肽链，使其分离成不同长度的肽段，并用每种肽段进行分离提纯。然后对每一肽段进行上一过程的操作，从而得到每一肽段的氨基酸排列顺序。再根据肽段重叠的部分进行组合，得到长肽链的序列。上述几种步骤的重复，最终测定出了胰岛素的所有氨基酸顺序。图2 对其中一个片段的分析参考文献[1]F.SANGER , H.TUPPY. The Amino-acid Sequence in the Phenylalany1 Chain of Insulin[2]F.SANGER. The Free Amino Groups of Insulin.[3] Ryle A P, Sanger F, Smith L F, Kitai R.The disulphide bonda of insulin.