第十章 基因工程课件.pptVIP

第九章基因工程 基本概念 DNA重组 不同来源的DNA分子可以通过末端共价连接（磷酸二酯键）而形成重新组合的DNA分子，这一过程称为DNA重组。 1973年 重组DNA技术建立 克隆 作名词使用时，是指由一个细胞经过无性繁殖以后所形成的子代群体。 作动词使用时，是指产生这一群体的过程。 基因克隆 是指在体外，借助于能自我复制的载体，将目的基因引入到宿主细胞中进行增殖，以获得大量的特定DNA片段。也称为重组DNA，分子克隆。 基因工程 指在体外将基因进行克隆，并利用克隆的基因表达、制备特定的蛋白质或多肽产物，或定向改造细胞乃至生物体的特性所用的方法及相关的工作。 基因工程的目的 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质） 第一节工 具 酶 一、限制酶 定义 是一类内切核酸酶，又称限制性核酸内切酶。能够识别双链DNA内部特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA。 + Bam HⅠ 作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。 分类 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型） 分类 Ⅰ型 Ⅱ型 Ⅲ型 限制-修饰活性 限制和修饰活性 限制酶与修饰酶分开 限制和修饰活性 蛋白质结构 三种不同亚基 相同亚基 二种不同亚基 辅助因子 Mg 2+、ATP、SAM Mg 2+ Mg 2+、ATP、 SAM* 切割位点 非特定，在识别位点下游100-1000bp 特定，在识别位点内，切割位点的序列可知、固定 切割位点难预测，在识别位点附近 1. 限制酶的分类 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。 2. 限制酶的命名 Hin dⅢ Haemophilus influenzae Rd株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) 切口 ：平端切口、粘端切口 3. 限制酶的识别和切割位点 4. 同功异源酶 + Bam HⅠ + BstⅠ 来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端。 Bam HⅠ Bg lⅡ + + 5. 同尾酶 限制酶 识别序列及切口 限制酶 识别序列及切口   Alu Ⅰ AG/CT Hind Ⅲ A/AGCTT TC/GA TTCGA/A BamHⅠ G/GATCC SalⅠ G/TCGAC CCGAG/G CAGCT/G BglⅠ A/GATCT SmaⅠ CCC/GGG TCTAG/A GGG/CCC EcoRⅠ G/AATTC CTTAA/G 常用限制性核酸内切酶酶切序列 单酶切 ? 用一种限制酶 酶切目的基因 和载体 ? 易发生自身连 接 双酶切 ? 用二种限制酶 酶切目的基因 和载体 ? 不易发生自身 连接 限制性核酸内切酶酶切方法 二、修饰酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端脱氧核苷酸转移酶 DNA聚合酶Ⅰ 是从E.coli中第一个发现的DNA聚合酶 催化活性 5’→3’聚合酶活性； 5’→3’和 3’ →5’外切酶活性 应用 在用切口平移法标记DNA探针时，常用此酶。 Klenow 片段 定义： 用枯草杆菌蛋白酶可将DNA聚合酶Ⅰ裂解为大小两个片段，大片段称为Klenow片段。 催化活性： 5’→3’聚合酶活性； 3’ →5’外切酶活性 应用： 补齐双链DNA的3’末端； 通过补齐3’末端而对其进行标记； 在cDNA克隆中，催化第二条链的合成； DNA序列的分析。 逆转录酶 常用两种类型 禽类成骨细胞性白血病病毒(AMV)逆转