基因的体外转录和翻译.ppt

第一节 基因的体外转录 一、基因体外转录的目的和意义 基因的体外转录体系最早由Pelham和Jakson于1976年创立的，经很多实验室的不断修订和改进，现已成为一项成熟的分子生物学和细胞生物学技术，已被多家试剂公司提供标准的实验程序。 基因体外翻译的基本原理 基因体外翻译的基本原理是以基因转录产物RNA为模板，在核糖体上进一步生产蛋白质的过程。 基因体外翻译的模板： 1、直接来自体外基因转录实验； 2、细胞内提取的mRNA； 3、通过PCR或RT-PCR产物转录后的RNA。 利用不同模板和翻译体系进行翻译时，应匹配相应的翻译起始序列。如用原核细胞翻译体系时RNA模板应含有SD序列，应用真核翻译体系时，应有帽子结构；在RNA的3ˊ未端含有合适的终止信号。 * 什么是基因的体外转录和翻译 基因的体外转录和翻译是20世纪70年代发展起来的一项分子生物学和细胞生物学实验技术，是研究离体条件下(非细胞体系)基因表达情况的理想体系。 基因表达包括：转录和翻译两个过程。 基因表达的调控包括：染色体结构的调节、DNA结构的调节、转录过程的调控、转录后的调控、翻译过程的调控及翻译后的调控。 基因体外转录和翻译的作用：为研究基因转录和蛋白质翻译提供了一个十分理想实验体系和技术平台及找到了一个研究与探讨转录和翻译这两个复杂的现象的重要手段和方法。 基因体外转录体系在分子生物学和细胞生物学研究中的用途和意义： 1、快速检测目的基因的转录情况； 2、分析转录因子调节基因转录的过程； 3、分析启动子序列的活性； 4、分析转录因子、DNA结合蛋白和RNA剪切因子的组成和作用； 5、染色质结构调整与基因转录的关系； 6、制备RNA探针。 一、基因体外转录的基本原理 基本原理：以DNA为模板，在无细胞体系中一系列转录因子的作用下经RNA聚合酶合成RNA的过程。 模板 质粒DNA 线性DNA 核小体形式存在的DNA 能用于体外转录的质粒载体 转录的必要条件：无论是真核细胞的转录体系还是原核细胞的转录体系，基因转录时都必须有启动子序列，且该序列能被转录体系识别。 原核细胞体外转录体系常用的启动子有T3、T7及SP6启动子。 真核细胞体外转录体系除需启动子，增强子等顺式作用元件外，还需各种反式作用元件的参与。 基因体外转录体系 DNA模板：含有转录启动子及必要的调控序列(起始和终止序列等)的DNA及为研究基因转录调控的需要,在体外组装成的核小体链(注意避免RNase的污染)。 细胞核抽提物：DNA转录由RNA聚合酶、各种转录因子及必要的环境条件等，这一切必需由细胞提供。常用于制备细胞核抽提物的细胞有酵母细胞、兔网织红细胞和Hela细胞 细胞核抽提物的制备： 1、一般方法 优点：细胞核完整、内含物丰富 缺点：在分离的细胞核中可能存在少量细胞质成分 (1)收集细胞：取5×106/ml的培养细胞20ml，1500rpm离心5min，用新配制的0.01mol/LPBS洗涤，收集细胞。 (2)低渗液裂解细胞并纯化细胞核：将收集的细胞迅速加入原体积1/10的低渗缓冲液[0.01mmol/ L HEPES(4－羟基乙基哌嗪乙磺酸) pH 7.9,10mmol/LKCl，1.5mmol/L DTT(二硫苏糖醇)，0.2mmol/L PMSF(苯甲基磺酰氟)]，冰浴30min，用玻璃匀浆器匀浆，3000rpm离心15min得细胞核沉淀。 (3)裂解细胞核：向细胞核沉淀中加入2倍体积的低盐缓冲液(20mmol/L HEPES，pH 7.9，25％甘油，1.5mmol/L MgCl2，20mmol/L KCl，0.2mmol/L EDTA，0.2mmol/L PMSF，0.5mmol/L DTT)，冰浴10min，用玻璃匀浆器匀浆。滴加入2倍核沉淀体积的高盐缓冲液冰浴 轻轻搅拌30min。 (4)收集核提取物：25000g离心30min，收集上清液后，用缓冲液透析2h后，4℃，25000g离心20min，上清液置-70℃保存。 (5)核提取物的蛋白定量：核抽提物总蛋白浓度采用Bradford法测定，以牛白蛋白为参照。 附：Bradford法测蛋白含量 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。 Bradford