SNP检测方法汇总..docxVIP

TaqMan SNP基因分型技术方法：此技术是由美国Life technologies公司研发的SNP分型技术，其技术原理如下简介。PCR 反应时，加入一对两端有不同荧光标记的特异探针来识别不同的等位基因（allele1和allele2），5’端为报告荧光基团（reporter），3’端为淬灭荧光基团 (quencher)。PCR过程中，两个探针能与正向引物和反向引物之间的互补序列特异退火结合。当探针以完整形式存在时，由于能量共振转移，荧光基团只发出微弱荧光。特异的探针与相应的等位基因杂合后，DNA聚合酶发挥5’到3’外切酶活性，把报告荧光基团切割下来，脱离了3’端淬灭荧光基团的淬灭作用 (quench)，从而发出荧光。两个探针的5’端标有不同的荧光 (FAM或VIC)，3’端标有MGB 淬灭基团结合体。根据检测到的不同荧光，可以判断相应的样本的SNP 等位基因型。整个技术的示意图如下：应用领域：本方法适用于多个涉及到SNP分型的遗传研究领域。尤其适合针对全基因组SNP关联研究获得的初步阳性位点，以及全基因组测序得到的大量初筛突变位点进行进一步的大样品验证研究。RFLP (多重荧光)SNP分型技术已知的很多SNP位点正好位于限制性内切酶的识别区域，针对这些SNP位点我们就可以使用此方法进行SNP分型。尤其是对于大样品量的多个SNP分型来说，此方法的优势较为明显。技术方法：　RFLP技术于1980年由人类遗传学家Bostein提出。它是第一代DNA分子标记技术。Donis—Keller利用此技术于1987年构建成第一张人的遗传图谱。DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，通过电泳将其区分。现在我们用荧光标记其PCR引物，通过测序毛细管电泳来精确区分酶切片段大小，精度可以达到1bp的差异。通过对同一个位点的PCR产物不同SIZE的引物设计，实现了多样本的多重酶切，大大降低了检测成本。我们可以利用限制性内切酶的特殊属性来对一些SNP进行分型。有些SNP多态位点正好处于限制性内切酶的识别位点处，其中一种多态对应的PCR扩增片断能够被相应的内切酶切动，而另一种却不能，因此通过对酶切后的PCR产物电泳后的片断长度分析可知检测样本在该位点处的基因型。如果检测SNP位点不存在合适的酶切位点，往往可以通过在PCR引物3’端改变个别碱基引入限制性内切酶酶切位点，通过这种引物修饰法可以实现绝大多数SNP位点的分型都能用RFLP分析来实现。整个技术的示意图(以KpnI酶切位点SNP为例)如下：现在我们通过荧光标记PCR引物中的一条引物，另一条引物设计在序列的不同位置实现了，多位点扩增，多样本一起酶切，酶切PCR产物通过跑测序毛细管电泳将其精确区分，大大降低其检测成本。应用领域：本方法涉及到很多需要对突变或者SNP多态进行分型的遗传研究领域。高温连接酶检测反应技术???多个SNP位点（3-8个）的分型项目，样本量可以几百个到上千个?技术方法：连接酶检测反应 (ligase detection reaction，LDR)是利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别。高温连接酶一旦检测到DNA与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配，则连接反应就不能进行。如下左图：右边的探针与模板有一个碱基不配对，所以连接反应不能进行，没有连接产物；左边的探针与模板DNA完全互补，故进行连接反应。通过温控循环该特异性连接反应可反复进行，达到线性扩增的效果。当检测到DNA与互补的两条寡聚核昔酸接头对应处存在着碱基错配，则连接反应就不能进行。在同时存在着荧光标记的探针时，由于前者与模板DNA互补，故它与下游探针的连接反应得以进行，而后者则无法与下游探针连接。在连接反应结束后进行测序仪检测，检测到的结果即为G，从而可认定该SNP位点为G。LDR检测方法利用长度差异可以将多重LDR产物在ABI测序系统中进行检测，实现一次检测多个SNP位点。应用领域：本方法适用于多个涉及到SNP分型的遗传研究领域。Multiplex SNaPshot?????? 针对性的解决多个SNP位点（8-16个）的基因分型项目，样本量灵活，从几百到上千个样品。?我公司利用由美国Life Technologies公司开发的SNaPshot技术，针对中等通量的SNP分型项目进行了技术上的改进大大提高了分型的通量和准确性。SNaPshot又称为小测序技术，是在一个含有测序酶，四种荧光标记的ddNTP,紧挨多态位点5’端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一