RNA提取详细步骤及注意事项-1.pptVIP

RNA提取 高级生化与分子生物学研究技术 目 录 1、试剂介绍 2、主要提取流程 3、详细步骤 4、注意事项 1、试剂介绍 本实验室提取RNA常用的抽提剂是全式金Trizol。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。Trizol在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化RNA及标准化RNA的生产十分有用。 2、主要提取流程 磨 样 加氯仿 转移水相 加乙醇 室温晾干 保 存 溶解RNA 测浓度 胶状物 加 Trizol 去杂质 1、剪取新鲜幼嫩叶片，置于液氮中慢慢反复研磨，直至其成为合格粉末为止。 2、加入1ml Trizol，晃动3-5下，再用枪吹打2-3下，确保全部裂解。 3、室温放置5分钟，使样品充分裂解。 12,000g、 4℃离心10分钟。 4、每毫升 Trizol加入0.2ml氯仿，猛烈晃动15秒，室温放置2-3分钟。 5、12,000g 4℃离心15分钟，然后吸取上层无色水相至一新的离心管中。 3、详细步骤 6、按1ml最初的Trizol加入0.5ml异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀10分钟。 7、12,000g、 4℃离心10分钟，弃上清，在管底可见RNA沉淀（透明胶状）。 8、每毫升最初的Trizol加入1ml 75%乙醇（DEPC水配制），剧烈震荡。 9、 7,500g 、4℃离心5分钟，弃上清。再用离心机甩一下（5,000rpm, 离心1分钟），小心吸尽液体。 10、待RNA略干后，加入20µl DEPC水溶解，-80℃冻存。 4、注意事项 1、所有离心管，枪头及相关溶液都必须无RNA酶污染。耐高温器物可放置于150℃烘烤4小时以去除RNA酶，其它器物去除RNA酶可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。溶液需用DEPC水配制。 2、必须戴一次性口罩和一次性手套操作。尽量不要对着RNA样品呼气或说话，以防RNA酶污染。 3、提取RNA整个过程中，尽量在低温下操作。 4、在操作中当加入变性剂氯仿后，须剧烈震荡，这样才能彻底使两相混匀。 5、在提取核酸时，如样品浓度低，则应增加有机溶剂沉淀时间，－80℃下30min或－20℃过夜将有助于增加核酸的沉淀量。 6、切勿让RNA过分干燥，否则将难溶解。 谢谢老师的评阅！