2.4_Plant-vector浅析.ppt

第 六 节 一. Ti质粒载体 根癌农杆菌及Ti质粒侵入植物细胞概略 2. Ti质粒载体 双元载体的特点 (1) T-DNA left and right border repeat sequences to define and delimit T-DNA (2) A plant-active selectable marker gene (usually for antibiotic or herbicide resistance). (3) Restriction endonuclease, rare-cutting, or homing endonuclease sites within T-DNA (4) Origin(s) of replication to allow maintenance in E. coli and Agrobacterium. (5) Antibiotic-resistance genes within the chromosome and within backbone sequences for selection of the binary vector in E. coli and Agrobacterium. T-DNA can be integrated into an Agrobacterium chromosome Vectors to facilitate integration of DNA into a specific neutral (i.e. not involved in virulence) region of the chromosome of A. tumefaciens C58 转基因植物过程 * * 植物分子克隆载体 G-菌,可侵入90科双子叶植物受伤组织，形成冠瘿瘤(crown gall tumor).冠瘿瘤细胞具有以下特征： i. 不需要补充植物激素便可进行离体培养 ii.合成肿瘤特有的化合物—冠瘿碱(opine),能专一的为根癌农杆菌所利用.这两个特征由Ti质粒决定,但该质粒中仅有一部分进入植物细胞. 1. 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)与Ti质粒 Ti 质粒类型 i. 鱆鱼碱类(octopine) ii. 胭脂碱类(nopaline) iii.农碱类(agropine) 2) Ti 质粒的结构 i. 环状ds-DNA,160-250kb,具六个功能区 i) 致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素 ii) 冠瘿碱合成区：参与冠瘿碱合成 iii) 冠瘿碱分解区：参与冠瘿碱分解 iv) Ti 质粒转移区(tra)：参与不同农杆菌中的接合转移 v) 毒(性)区：参与T-DNA的转移和插入植物染色体 vi) DNA复制区：参与Ti 质粒DNA复制 ii. T-DNA T-DNA包括植物激素冠瘿碱合成区基因及两侧相同的25 bp重复序列，T-DNA整合不具特异性，右侧25 bp重复序列对T-DNA的转移至关重要。 不同Ti 质粒中的T-DNA结构是不相同的，其中 i) 胭脂碱Ti 质粒的T-DNA长23 kp,结构连续，具13个基因 ??? ii) 鱆鱼碱Ti 质粒中的T-DNA不连续，分左右两段，分别称之为TL和TR, TLDNA长13.2 kb,含8个基因，包括鱆鱼碱合成酶和植物激素合成基因, TR –DNA长7.9 kb，含5个基因，参与甘露碱(mannopine)和农碱合成 iii)两者同源性：主要集中在植物激素合成区。 Ti质粒的T-DNA的同源性 1) Ti质粒作为载体的问题 ??????? i) 太大，无适合克隆位点 ???????ii) T-DNA的存在不能使转化细胞再生为完整植株 2) 载体类型 i)中间载体(intermediate vector) 由以下几部分组成： ?适合于E.coli和A.tumefaciens自主复制和选择用标记基因 ?适合于植物细胞选择用标记基因 ?一段来自天然Ti质粒的部分T-DNA序列(提供同源重组) ?1-2个来自T-DNA的25 bp重复序列 ?表达外源基因的DNA序列(如启动子、终止子序列) Genes of interest (goi) are exchanged into the T-