免疫组化总结..docVIP

绪论 组织化学（histochemistry）也称细胞化学(cytochemistry),是运用物理学、化学、免疫学、分子生物学等原理与技术，对组织与细胞的化学成分或酶活性进行定性、定位和定量研究的科学。 组织化学发展的基础 扫描隧道显微镜原理：扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope，STM） 由Binnig等1981年发明，根据量子力学原理中的隧道效应而设计。当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV－2V），针尖与样品之间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流。 特点：扫描隧道显微镜的分辨率很高，横向为0.1－0.2nm，纵向可达0.001nm。它的优点是三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察，而普通电镜只能观察制作好的固体标应用：利用扫描隧道显微镜直接观察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵，和某些生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列。使放大倍数可达数千万倍 固定（fixation）的目的是用人为的方法尽可能使组织细胞的形态结构和化学成分保持生活状态，防止组织细胞死后发生自溶和组织腐败。固定还能增加组织块硬度，使其更容易切片，使不同的结构更容易染色。 一、组织和细胞的固定方法 固定方法有物理固定和化学固定两类，物理固定可采用空气干燥（血涂片）、骤冷（在液氮中迅速冷冻）或微波固定等；化学固定有浸润法(immersion method)和灌流法（perfusion method）。 （一）浸润法 :浸润法是组织化学和免疫组织化学常用的固定方法，一次要处理许多组织样品时也多用此法。预先需估计固定剂的用量，并在取材前配好固定液。固定液的用量应是样品的40倍，以保证组织充分固定。固定时间可根据所选固定液和组织类型而定。若进行酶组织化学染色，应在4℃短时间固定，固定时间长会导致酶活性减弱，甚至消失。 （二）灌流固定法 :此法是经血管途径，将固定液灌注到欲固定的器官内，使生活的细胞在原位及时迅速固定，取下组织之后再浸入相同的固定液内继续固定。灌流固定时大动物多采用输液方式，小动物多采用心脏主动脉灌流，如大、小鼠。在灌注固定液前，先用含抗凝剂的37 ℃生理盐水灌流，冲洗血管内的血液，防止血液凝固阻塞血管。肝脏由鲜红颜色变为浅白色时，即可灌流固定液，灌注速度为5 -10ml/min，应在30min内结束灌注并取材，而后将组织浸入相同的固定液中1～3小时。灌流固定对组织结构和酶活性保存较好。 常用固定剂和固定方法 （一）组织常用固定剂和固定方法 1．甲醛 是常用的醛类固定剂 .其特点是组织形态结构保存好，穿透性强，组织收缩少。 （1）10% 中性缓冲福尔马林 （2） 4% 多聚甲醛磷酸缓冲液 2. 丙酮 3. 醇类 4.混合固定试剂 (1) Bouin’s液：组织通常在4℃下固定6(8h。此固定剂对肾脏结构保存不利。 (2) Zamboni液：该固定液可用于光镜、电镜免疫细胞化学观察。固定时间以6(18h为宜。 (3) AAF 液（95%-100%乙醇85mL，冰醋酸5ML，浓甲醛10ML）：较常用的固定液。 (4) Clarke 改良固定剂（ 100% 乙醇75mL，冰醋酸25 mL），常用于冰冻切片的后固定。 (二) 培养细胞常用固定剂和固定方法 在固定之前需用37℃预热的PBS轻洗细胞。1. 4%多聚甲醛磷酸缓冲液：固定10(20min,干燥。2.甲醇：-10℃甲醇固定5(20min, 自然干燥。3.丙酮：4 ℃冷丙酮固定组织穿透性和脱水性强，抗原保存好，很少用于组织切片，常用于培养细胞和细胞涂片的固定，平时丙酮 4 ℃ 低温保存备用，临用时，将载玻片插入冷丙酮内 5~10min，取出后自然干燥。4.乙醇：95% 乙醇脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量，因而固定时间不宜过长（2h内）。乙醇使蛋白变性程度轻，固定后蛋白可再溶解，在染色中孵育时间长的情况下，抗原可流失，并减弱反应强度。5.乙醚（或氯仿）与乙醇等量混合对组织穿透性极强，即使涂片上含较多的黏液，固定效果仍较好，是理想的细胞固定液。 第三节、包埋和切片 一、石蜡包埋 （一）包埋前脱水 脱水(dehydration)是用梯度乙醇将固定好的组织内的水分脱去。脱水的时间长短与组织块的大小，结构有关。—般过程：70％、80％乙醇可以长期的保存组织，90％乙醇4h，95％4h，100％乙醇(Ⅰ)2h，100％乙醇(Ⅱ)2h。 透明 常用的透明剂是二甲苯。透明的时间长短与组织的大小、结构有关。一般过程是:二甲苯Ⅰ0.5～1h，二甲苯Ⅱ 0.5～1h。应注意脱水和透明的时间一定要充分，否则，不利于浸蜡，易使石蜡与组织之间形成夹层而使切片困难。但时间也不能