细菌内毒素检查技术应用与发展.pptxVIP

细菌内毒素检查技术的应用与发展赵金锁2016.4.31.热源分类—按检查法区分1：内毒素热源 —革兰氏阴性细菌细胞壁的组分2：非内毒素热源 —除内毒素外的热源2热源的检查方法 2.1 体内热源的检查方法—兔温法（PT） .是一种体内、全热源的检查方法 .1942年USP12版第一次收载该法 .各国药典至今仍然使用该发2.2体外热源检查法（IPT） .是一种体外的利用人血细胞反应的全热源原检查法。 .在2000年前，尚未有药典收载该法，但欧洲药典在2005年后率先收载该法。 .IPT有取代PT的趋势2.3细菌内毒素检查法（BET） .热源=内毒素？学术上的争论 .医药工业接受的观点 —控制内毒素污染就等于控制热源污染3历史回顾—鲎试剂的发明与BET的应用 .1956年，美国科学家F.Bang发表论文《鲎的一种细菌性疾病》，阐述了细菌内毒素使鲎血凝固的现象，从而拉开了BET研究与应用的帷幕。 4.BET技术与应用的发展趋势与特点4.1 BET取代PT成为必然的趋势.1980年USP收载BET法，但未规定任何品种应用，1999年USP版规定670种药品作BET项，仅约20种药品保留PT项。.1993年CP1990版增补本收载BET法，同样未涉及任何品种使用，CP2000年版有近70个品种规定作BET项。CP2005年版有超过150种药品规定作BET项。.其它国家药典对药品的BET项，同样经历了从无到有，从少到多的过程。BET取代PT是已成为必然的趋势。4.2走向统一的BET发已成为发展的趋势.在初期各国颁发的BET不尽相同，影响药品的流通。.USP、EP及JP率先统一BET法，于2001年1月1日起实施。.CP2005年版BET法的修订，基本参照USP、EP及JP的统一BET法。4.BET技术与应用的发展趋势与特点4.3BET技术及应用的发展特点4.3.1 BET方法学呈多样化 .凝胶法—最经典的方法 .光度法（浊度法和显色基质法）4.3.2BET方法的选择 .供试品检测时可以选择任何一种方法进行试验 .当两种测试结果有争议的时候，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 .试验用BET水及器皿的要求：凝胶法，BET水内毒素应小于0.015EU/Mml，光度法，BET水内毒素应小于0.005EU/ml。所用器皿应用干热灭菌法（250℃，不少于0.5h）去除热源，若使用塑料器械，应选用无内毒素及对试验无干扰的器械。 4.BET技术与应用的发展趋势与特点4.4 BET方法趋向自动化.凝胶法BET —在自动化方面没有新的发展 —孵育设备方面，干式恒温器逐渐取代恒温水浴槽.定量法BET —试管式定量检测仪（32-108孔），如Ati-320动态试管仪 —酶标板式定量检测仪（96-384孔） —单波长/多波长/可变波长测定仪（300-1000nm） —专用数据处理软件5凝胶法实验技术5.1实验准备5.1.1凝胶法的实验程序 a：试验准备：试剂、仪器及用具等 b：确定药品的细菌内毒限值（L) c：选择鲎试剂的灵敏度（λ） d：计算供试品的最大有效稀释倍数（MVD）或最低有效浓度（MVC） e：鲎试剂灵敏度复核 f：干扰实验的验证 g：供试品日常的内毒素限量检查5.1.2实验材料和器具 a：仪器设备：37℃恒温水浴或适宜的恒温器 b：器具：要除热源处理 c：试剂：鲎试剂具有国家生产许可证。5凝胶法实验技术5.2鲎试剂的灵敏度复核试验 5.2.1过程：根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品用BET水溶解，在漩涡混合器上混合15min，然后稀释制成2λ、1λ、0.5λ和0.25λ的4个浓度的细菌内毒素标准溶液，注意，每稀释一次要在漩涡混合器上混合30s，取鲎试剂18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的细菌内毒素标准溶液，每一个细菌内毒素标准溶液平行做4管，另2管加入BET水作为阴性对照，封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温器中，保温60min ±2min。 5.2.2阳阴性判断：试验结束后，将试管轻轻取出，缓缓倒转180度，若管内形成凝胶且不变形不从管内滑脱者为阳性。未形成凝胶或者形成凝胶不结实、变形并从管内滑脱者为阴性。注意，操作过程要轻拿轻放，避免因震动造成的假阴性结果。5.2.3结果判断：当最大浓度管（2λ）为阳性，最小浓度管（ 0.25λ）为阴性，阴性对照管为阴性，该试验有效。计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc），当λc在0.5λ～2.0λ时方可进行细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。5凝胶法实验技术5.3供试品的干扰试验5.3.1目的：判断某种检品在某种浓度下下是否适合作细菌内毒素检查。5.3.2原理：比较鲎试剂与内毒素的反应在水溶液中进行和在检品溶液中进行的差异，也就是比较反应在不