实验一根霉曲糖化能力的测定.docVIP

本科学生实验报告 学号 104120214 姓名 李 飞 学院 生命科学学院 专业、班级 应生12A班 实验课程名称 发酵工程学 指导教师及职称 许 波 开课时间 2014 至 2015 学年 下 学期 云南师范大学教务处编印 实验名称：根霉曲糖化能力的测定 实验时间：2015.3.30 是否小组合作：是 小组成员:李甜、陈颖 一、实验目的 1、了解标准曲线的制作和使用方法 2、掌握DNS（3,5-二硝基水杨酸）法测定糖化酶活力的基本原理和方法 3、学会计算糖化酶的糖化DE 二、实验设备及材料 1、实验材料：根霉曲 柠檬酸缓冲液 DNS 0.1%葡萄糖溶液 1%淀粉溶液 2、实验设备：天平、烧杯、三角瓶、水浴锅、离心机、722分光光度计 实验原理 1、淀粉：由葡萄糖通过α-1,4糖苷键构成的直链淀粉和α-1,6位有分支的支链淀粉组成，其水解需淀粉酶和糖化酶的作用； 淀粉酶的作用：首先酶解淀粉为小分子的糊精、寡糖和少量单糖； 糖化酶的作用：其次通过糖化酶的作用将小分子的糊精和寡糖降解为还原性的单糖。 2、DNS法：利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量的。 3、 DE（Dextrose Equivalent，葡萄糖值）：是糖化液中还原糖（以葡萄糖计）占干物质的百分比，工业上用DE值表示淀粉的水解程度或糖化程度。 4、酶活是指在50℃、pH4.8条件下，每分钟内每毫升酶液降解淀粉底物产生1μmoL葡萄糖所需要的酶量定义为一个国际单位（IU）。 四、实验方法步骤及注意事项 1、绘制标准曲线的方法 （1）先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定吸光度A。 取7支试管，编号，按照下表进行操作： 葡萄糖溶液体积（ml） 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 葡萄糖含量（mg） 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 缓冲液（ml） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 DNS?(ml) 3 3 3 3 3 3 3 沸水浴煮5min流水冷却,加蒸馏水10mL，混匀 定容总体积(ml) 15 15 15 15 15 15 15 OD（540nm） A、B（样品）吸取1.8mL淀粉溶液于试管中 50℃保温5min 加入待测酶液0.2mL 50℃精确保温10min 加入3mLDNS试剂终止反应 摇匀 入沸水浴煮沸5min 流水冷却 加蒸馏水10mL 混匀 以C为空白调零，540nm测定样品的OD值 C（对照） 吸取1.8mL淀粉溶液于试管中 50℃保温5min 50℃精确保温10min 加入3mLDNS试剂 摇匀 加入待测酶液0.2mL,入沸水浴煮沸5min 流水冷却 加蒸馏水10mL 混匀 糖化DE值的计算 DE%=还原糖含量/淀粉含量×100 计算公式=(K×OD+b)*15/（1.8 ×1% ×1000) × 100 淀粉酶的液化效果检测 试管A 吸取1mL淀粉溶液于试管中 50℃保温5min 加入待测酶液1mL 50℃精确保温5min