基因工程复习终结版.docVIP

第一章： 基因工程（老师的）：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA），转入微生物，植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。 书本的：按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，有目的的改造生物种姓，使现有的物种在较短的时间内趋于完善，创造出更符合人们需求的新的生物类型。 基因工程理论基础P1（一般） 不同的基因具有相同的物质基础。（地球上一切生物，它们的基因具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片段；所有生物的DNA基本结构一样） 基因是可切割的。 基因是可以转移的。 多肽与基因之间存在对应关系。 遗传密码是通用的。 基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。 第二章 一、基本技术路线：a、目的基因的获取b、重组体的制备（载体）c、转化(受体:原核生物/植物/真核微生物等)。d、克隆鉴定（受体细胞大量复制到一定数量，鉴定目的基因是否进入目的受体细胞）。e、目的基因扩增（分离成功改造的受体细胞，使复制）。f、目的基因表达 二、操作原理（DNA提取制备，RNA提取制备、检测：提取含量，分子量，纯度） DNA提取制备（以质粒DNA为代表）：a、溶菌（溶解细菌细胞壁）b、细菌细胞膜破坏，蛋白质和DNA变性（体内外，缠绕沉淀，但是质粒不加入去缠）c、中和（质粒复性而蛋白质和DNA变性沉淀）d离心去沉淀e、纯化DNA（过柱等）f沉淀DNA（无水乙醇或异丙醇）g、离心（取沉淀） 总的DNA：a、准备生物材料b、裂解细胞（因生物种类不同而不同）c、分离和抽提DNA，（只需在细胞裂解液中加入适量的酚或其他有机溶剂）使之与蛋白质分开。 选材原则：确定生物种类外，a、处于提取DNA得率最高的生长期，或者是DNA容易提取和含量高的组织b、（提取大肠杆菌源质粒DNA）应把菌液培养至对数生长期后期。c、植物DNA，选用幼嫩的植株d动物组织，清楚高活性的酶。 RNA提取制备（与DNA的相似）但关键：防止RNA酶的污染（a避免外源RNA酶的污染：制取RNA的玻璃器皿要灭菌处理b抑制内源性RNA酶的活性：加入强变性剂使之失活c在RNA的反应体系加入RNA酶抑制剂） 两个制备RNA的常用方法：a酸性胍盐/苯酚/氯仿抽提（强烈变性剂，除尽蛋白质）b氯化铯密度梯度离心 分离提取如何除杂质？（分滤法异戊醇） 检测：提取含量，分子量，纯度 提取含量：琼脂糖凝胶电泳估计（原理：利用溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中，紫外光照下能发红色荧光，荧光强度与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA含量） 分子量：琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA标准混合液对比得知（Marker） 核酸定量：关键词：地衣酚，糠醛反应，紫外分光光度计 。 紫外光谱：关键词：260nm有吸收峰 电泳的基本原理：1、带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率2、电泳迁移率同电厂的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比3、电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比C电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数称反比。4.摩擦系数主要与分子大小形状及介质粘度有关。5.如果场强 一定（电压和电极距离），电泳介相相同，分子在电场中的迁移速度主要取决于分子本身的大小和形状（分子相对质量相关） 方法：琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳 三、分子克隆工具酶（7种）作用范围和原理 限制性核酸内切酶:是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4-8bp）,并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。（而S1核酸酶只切割讲解单链的DNA或RNA，对双链的DNA或RNA或DNA和RNA的杂交体相对不敏感。） 作用：切割DNA分子，获得含有完整基因、复制起始位点、转录启动子或转录区等具有特定功能的DNA片段。 （一般）类别： I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS，位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸）。 II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅcoli中这两种基因位于质粒上。 III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的（只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，被广泛应用在基因工程上）。 （了解）命名： 限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。例如：HindⅢ　　前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。作用部位：两个单核苷酸之间连接的磷酸二酯键 切割对象：双链DNA，对单链DNA不起作用 作用位置：两个核糖核苷酸的磷酸二酯键，