流式细胞仪-上课-2014概论.ppt

* * * 17 * * * * * Doublets * * * * In A, the amount of fluorescence emission detected by the PE detector and the amount of PE fluorescence detected by the FITC detector is shown. After compensation, B, the particles show only their appropriate fluorescence emission. * * Combining signals from the green-fluorescent JC-1 monomer (absorption/emission maxima ~510/527 nm) and the red-fluorescent J-aggregate ( ) (absorption/emission maxima ~585/590 nm), For flow cytometry, JC-1 can be excited at 488 nm and detected using the green channel for the monomer and the red channel for the J-aggregate form * * * * * Uncompensated vs Compensated * * 流式细胞仪概况 流式细胞仪的工作原理及数据分析 DNA分析 原理、应用、实验步骤、注意事项 T淋巴细胞亚群分析 原理、应用、实验步骤、注意事项 流式细胞仪的其他应用 主要内容 * * 细胞膜的变化 DNA含量的变化 酶活性 线粒体膜电位变化 侧向散射光 细胞凋亡分析 Annexin-V 检测细胞凋亡 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（PE、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的 细胞和死细胞，PI能够透过细胞 膜而使细胞核染红。因此将 Annexin V与PI匹配使用，就可以 将处于不同凋亡时期的细胞区分 开来。 * * * * Annexin-V 检测细胞凋亡 正常活细胞Annexin V 、PI均低染；凋亡细胞Annexin V高染、PI低染；坏死细胞Annexin V/PI均高染 * * 细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上荧光素 (FITC) 标记的dUTP (fluorescein-dUTP) ，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。这就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 法检测细胞凋亡的原理 BrdU检测细胞凋亡 * * TUNEL Assay with anti-BrdU BrdU检测细胞凋亡 DNA degradation * * Caspase-3 检测细胞凋亡 Casepase 3是一个凋亡相关的信号传导蛋白，以PE标记的抗体进行胞浆染色，可以观察表达Caspase 3蛋白的细胞的比例和强度。 JC-1 ? JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)△Ψm 的理想荧光探针。 在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体(monomer)，可以产生绿色荧光。 * *