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微生物学实验指导 （怀化学院微生物学课程组） 一、课程性质、地位和作用 微生物学实验是专业的课程，为了配合微生物学的教学而开设的。我们将微生物学实验项目按微生物学研究和生产实践程序而构建成一个综合性整体。在这个综合性系统中，包含了要掌握的各项微生物学技术。实验项目保分为验证性实验部分、综合性实验部分、设计性实验部分和研究性实验部分。我们希望通过本实验的教学，培养学生掌握微生物学基本操作技能，具备较强的观察、思考、分析问题的能力，能解决微生物学研究和生产领域实际问题的基本能力；养成实事求是、严肃认真的科学态度以及勤俭节约、爱护公物的良好作风。 二、考核方法与要求 1．平时成绩：包括出勤、实验操作，实验效果、讨论情况等，占30% 2．报告成绩：实验报告等，占0% 3．考试成绩：%；理论考试，30% 4．综合考核成绩：平时成绩+设计成绩+报告成绩+考试成绩 实验一 培养基的制备与灭菌 一、实验目的 二、实验 1． 三、实验材料和用具 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、链霉素、1mol/L NaOH、1mol/L H Cl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布 四、操作步骤 (一 )牛肉膏蛋白胨培养基的配制 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下: 牛肉膏3g，蛋白胨l0g，NaCl 5g，琼脂15-20g, 水1000mL，pH 7.4—7.6 1. 称量按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放人热水中，牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 2. 加热溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，在此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。 3. 调pH检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1mol/LHCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。 4. 过滤液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基，此步可省略。 5. 分装实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上面造成污染。分装量：固体培养基约为试管高度的1／5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积内一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/4为宜．灭菌后垂直待凝。 6. 加棉塞试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞，棉塞制作方法则图1－1。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利透气的作用。要使棉塞总长约3／5塞人试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的透气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料盖代替棉塞。 7. 包扎加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应先把试管扎成捆后，再于棉塞外包—层牛皮纸。然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。 8. 灭菌将上述培养基于121．3℃湿热灭菌20min。如因特殊情况没能及时灭菌，则应放人冰箱内暂时保存。 9. 摆斜面灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜面长度不超过试管总长的一半。 10. 无菌检查。将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24-48h，无菌生长时可以使用，或放置在冰箱或清洁的橱内，备用。 图1-1 棉塞的制作过程 (二)高氏1号培养基的配制 高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下： 可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl 0.5g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgS04·7H2O 0.5g ，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂15—20g, 水1000mI，pH 7.2-7.4。 1. 称量和溶解经计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放人小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解，再加入其他成分依次溶解。对微量成分FeSO4.7H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在100mL水中加入1g的FeSO4.7H2O，配成浓度为