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血友病B的基因治疗 中华血液学杂志?2013-10-15?分享血友病B是一种X染色体连锁隐性遗传病，因编码基因的改变而导致凝血因子（F）的缺乏。在男性中发病率约为1/25 000 ，依据血浆F活性（FC）分为重型（FC1%）、中间型（F C 1%~5%）和轻型（F C 5% ，≤40%）。 目前该病主要治疗手段为替代治疗（输注血浆提取物或重组F制剂），但反复输注外源性F可引起F抑制物形成、血制品输注相关疾病且医疗费用昂贵。 基因治疗则为血友病的长期缓解乃至治愈带来了希望。靶组织或细胞选择范围广泛、F基因片段小、低水平表达即可明显改善出血、具有良好的动物模型等优势，使得血友病B成为基因治疗领域进展最为迅速的疾病之一。 一.载体系统 1.腺相关病毒载体：腺相关病毒载体（AAV）是目前血友病B基因治疗最有前景的载体。AAV是一种可感染人细胞、具有天然复制缺陷的单链DNA 病毒，与已知人类疾病无关。AAV较之其他病毒载体具有免疫原性弱、转染效率高、可转染非分裂细胞、表达稳定且持续时间长等优点，缺点为容量小、基因表达滞后。 AAV包括AAV1、2、5、6、7、8、9 等多种血清型。AAV2 是应用最早、最广泛的血清型，可有效转染多种细胞，但人类是AAV2的天然宿主，人群中AAV2血清抗体阳性者较为常见。其他几种血清型则有不同的转染趋向性：AAV1具有明显的骨骼肌趋向性，AAV6具有心肌趋向性，AAV8具有明显的肝趋向性。针对不同的靶组织可以考虑选择趋向性不同的AAV。 总体而言，AAV7、8、9 产生的免疫反应较AAV1、2、5 轻。Wang 等分别应用AAV1、2、5、7、8、9 对F基因敲除小鼠和患血友病B犬进行基因治疗，然后对血浆中FC、抗F特异性IgG1 和IFN-γ进行检测，以比较其转染效率和免疫反应。 结果显示以肌肉组织作为靶组织时，AAV7、8、9 转染效率高于AAV1、2、5，未发现针对导入的F基因的B细胞反应，针对病毒衣壳蛋白的T细胞反应程度亦较弱。自身互补AAV 载体（self-complementaryAAV, scAAV）的发明则弥补了传统单链AAV 载体（singlestrandedAAV, ssAAV）表达滞后的缺点。 ssAAV表达滞后的原因在于其进入靶细胞并脱壳后，首先要合成互补DNA链才能进一步表达。scAAV则是将载体基因设计成1 个单链反向重复序列，当载体进入靶细胞后即可折叠形成1 条互补双链，从而绕开影响基因表达速度的步骤。 Nathwani 等采用scAAV5 和scAAV8 作为携带F编码基因的载体对患血友病B猕猴进行基因治疗并研究其安全性。研究者将猕猴分为5 组，分别从外周静脉注射2×109~2×1012 载体基因组（vg）/kg 共5 个剂量级的载体，然后对基因表达效率和安全性进行了长达5 年的观察。 研究发现，当载体剂量达到6×1010 vg/kg 时，猕猴血浆FC维持在1%以上；所有的猕猴均产生了血清型特异性抗体，未发现衣壳蛋白特异性T细胞反应和免疫介导的肝损伤，同时没有观察到AAV基因整合到靶细胞基因序列中和肝脏肿瘤的发生。该研究及大量制备scAAV的方法为临床试验打下了基础。AAV的缺点为包装容量较小，影响了在血友病A等其他基因缺陷性疾病的应用。 2.逆转录病毒载体： 逆转录病毒载体（RV）是最早应用于基因治疗的病毒载体，但仅对分裂细胞有效，对非分裂细胞则无效。Zhang 等以RV作为载体、以肝脏作为靶组织对新生血友病B犬和新生基因敲除血友病B小鼠进行基因治疗，结果显示所有动物中FC10%，无F抑制物形成。 但成年动物的肝脏中分裂细胞不足，有报道以手术切除部分肝脏的方法诱导肝细胞增殖，再应用RV进行基因治疗，但该治疗方法创伤较大，与其他载体相比劣势较为明显。 3.腺病毒载体： 腺病毒载体（AV）可转染分裂细胞和非分裂细胞。腺病毒基因不与宿主基因整合，不会因为基因整合而导致抑癌基因失活。人群可天然感染腺病毒而易预存免疫反应。第二代AV（高容量AV）腺病毒本身的编码基因被去除，可以降低宿主免疫反应，延长导入基因表达持续的时间。 4.慢病毒载体： 慢病毒载体（LV）是以HIV-1 为基础发展起来的基因治疗载体，可转基因至分裂细胞和非分裂细胞，对包括肝在内的各种组织都可转染，也可将载体基因整合至宿主基因中。因为LV来源于HIV，在普通人群中少有感染，很少有预存免疫反应，在基因治疗上具有一定的优势。 但是应用LV作为载体进行基因治疗时，FC仅接近1%，且有一过性急性促炎性免疫反应发生。Brown等应用携带肝细胞特异性启动子的LV载体对基因敲除血友病B小鼠进行治疗，FC因抗F的T细胞反应而未达治疗水平（1%），当他们在载体中再包进一段造血特异性miRNA后进行基因治疗，小鼠体内FC持续高于15