水稻转基因方法 自水稻转基因方法 自己.doc

转基因步骤：2-3月完成 水稻幼胚愈伤组织的培养 1.去壳成熟的水稻种子经70%乙醇消毒5min。 2.倒去乙醇，再用2.5%次氯酸钠（每50mL加一滴吐温20）消毒15min，无菌水洗5次，再用2.5%次氯酸钠消毒15min，再用无菌水浸泡30min。 3．倒去次氯酸钠，将种子倒到无菌滤纸上吸干，再将种子放在N6D（0.6% Gelrite）培养基上29.5度光照培养30-60天（白天12h29.5度，晚上12h29.5度）。 注;培养基每2周换一次。 农杆菌的准备 1．选择有活力的愈伤组织（相对干的、淡黄色的。如图1）转到新的N6D培养基上，29.5度光照培养3天。 注: 褐色的愈伤千万不能选，不然会影响转化效率。 2．挑取含有目的基因的农杆菌单菌落或吸取所保存的农杆菌液100ul于5ML YEP培养液中（50mg/l Kan+， 50mg/l（利福平） Str+），28度、250rp振荡培养12-36h至OD600饱和。 3.从上述菌液中吸取500ul于50mlYEP培养液中（50mg/l Kan+， 50mg/l（利福平） Str+）. 28度、250rp振荡培养12-36h至OD600=0.6-0.8。 注;农杆菌培养时要避光。因为农杆菌对光敏感。 农杆菌本身对利福平有抗性，质粒对Kan+ 有抗性，所以能在YEP培养基中（50mg/l Kan+， 50mg/l（利福平） Str+）生长的菌斑基本上转进去质粒了，只需做下菌落PCR验证下。 农杆菌的侵染 1．取15ml培养好的菌液，4度，4000rpm离心10min，去上清。 2. 挑取农杆菌放入30ml AAM感菌液中（10-20mg/l AS），轻轻混匀使OD600=0.05-0.1。 3．将愈伤放入无菌50ml离心管中。（在准备一个滤膜） 4．将步骤2中农杆菌液倒入步骤3中，侵染90s，其中不停要摇晃。 5．弃菌液，将愈伤组织取出置于无菌滤纸上沥干30-45min。 注：这步特别重要，因为过多的农杆菌会抑制愈伤的生长 6.把无菌滤纸放在2N6-AS培养基上。再把含有30ul 1000*AS的1mlAAM滴在无菌滤纸上，把侵染过的愈伤放在滤纸上。 7．28度暗培养48-60h。 抗性愈伤的筛选 1.把愈伤取出，放入50ml的离心管中，加无菌水5-8次，其间不 地震荡，直到水清澈为止就不用换水了。 2.用含有500mg/l Car无菌水清洗2次，每次30min。 3.将管中的愈伤倒在无菌滤纸上沥干1-2h。 注: 除去过多的水对愈伤的正常生长非常重要。 4.将愈伤转到N6D-S上，每皿最多16粒。 16.29.5度光照培养3-4周（图3）。 17.再将愈伤转到MS-NK培养基上，长根。 18.29.5度光照培养3-4周。 19.将根长3-4cm的幼苗跳出，转入MS-HF培养基上。 20．再转移到土中培养。 药品： 70% 酒精、1.5%次氯酸钠 100* N6-vitamins： Dissolve 100 mg glycine（甘氨酸）, 25 mg nicotinic acid（烟酸）, 25 mg pyridoxine hydrochloride（盐酸吡哆醇） and 50 mg thiamine hydrochloride（盐酸硫胺素） the volume to 500 ml withdistilled water. Store at 4 1C. 20* AB buffer Dissolve 60 g dipotassium hydrogenphosphate（K2HPO4） and 20 g sodium dihydrogenphosphate dihydrate（NaH2PO4?2H2O） in 800 ml distilled water; Adjust the pH to 7.2 and adjust the volume to 1 liter with distilled water and autoclave. Store at room temperature (20–25 C) 20* AB salts Dissolve 20g ammonium chloride（NH4Cl）, 6g magnesium sulfate heptahydrate（MgSO4?7H2O）, 3g potassium chloride（KCl）, 240 mg calcium chloride dihydrate（CaCl2?2H2O） and 50 mg iron (II) sulfate heptahydrate（FeSO4?7H2O） in 800 ml distilled water; adjust the volume