QIAGEN中提DNA中文操作手册..docx

质粒DNA中提方法（QIAfilter midi kit 25）适用于100 微克的高质粒或粘粒 DNA，使用 QIAfilter注射器样元件代替常规离心法以清除细菌裂解物。低拷贝质粒，加入氯霉素放大后应视为高拷贝。为质粒选择适当的培养体系。在开始之前的注意事项■如果是低拷贝，最好增加裂解buffer的用量，以提高裂解效率，裂解缓冲卷，从而增加DNA 产量。■可选：删除样品的步骤用符号表示?为监测分析凝胶（见第 34 页）的过程。■加入buffer P3后，样品不再需要冰浴。在开始之前做的东西■把提供的RNase A添加到buffer P1 中。一瓶RNase A (使用之前简要地离心）加入一瓶buffer P1 ，终浓度为100 ug/ml。■检查buffer P2 是否由于低温存储产生SDS沉淀。如有必要， 37 ° C下使SDS溶解。.■在4 °C预冷buffer P3。■可选：使用前将提供的 LyseBlue 试剂添加到buffer P1 混合。每个buffer P1 瓶加入一小瓶 LyseBlue （在使用之前简要离心），达到 1: 1000 稀释。LyseBlue 可以提供视觉识别从而防止常见处理错误，如细胞裂解导致效率低下和不完全沉淀的 SDS、基因组 DNA污染、细胞碎片等。过程1.摇菌：新鲜划线的选择性平板（接种含有适当的选择性抗生素）挑一个单菌落放入2-5 ml LB 培养基中。在 37 ° C 摇菌约8 h（约 300 rpm）。使用4倍体系容积的试管或锥形瓶。2.稀释选择性 LB 培养基 1/500 -1/1000。若为高拷贝质粒，接种到25 毫升或● 100 毫升的介质具有▲ 25—50 μ l 或● 100 – 200 μ l 起始培养液。若为低拷贝质粒，接种▲ 50 — 100 毫升或● 250 毫升的介质具有▲ 100 – 200 μ l 或● 250-500 μ l 起始培养基。在 37 ° C 摇晃 12 – 16 h（约 300 rpm）。使用烧瓶或其他容器至少4 倍于培养液体系。培养液细菌密度应该达到约 3-4 x 109 个/毫升3.收获细菌：6000 x g、 4 ° C离心 15 分钟。弃上清4.加入▲ 4 毫升或● 10 毫升buffer P1。为保证高效裂解，重要的是要使用是足够大，以允许完全混合裂解缓冲的容器。确保RNArase A 已被添加到buffer P1。如果 LyseBlue 试剂已添加到buffer P1，使用之前大力摇晃buffer，以确保 LyseBlue 粒子完全悬浮。细菌向上和向下翻转直到没有细菌块凝结。5.添加▲ 4 毫升或● 10 毫升buffer P2，通过大力翻转反应管管 4 — 6 次，彻底混合，在室温（15-25 ° C）反应 5min。不要剧烈震荡，这将导致基因组DNA的污染。裂解物出现粘性。不允许裂解反应持续超过 5 分钟。在使用后，buffer P2 的瓶子应立即关闭以避免空气中CO2中和NaOH。如果 LyseBlue 已添加到buffer P1 ，buffer P2 加入后将会变成蓝色细胞悬浮液。翻转后应为蓝色均匀悬浮。如果无色区域或褐色细胞块是仍然可见，继续翻转直至达到均匀蓝色。在反应时间准备 QIAfilter Cartridge（桶管）：将盖子拧到QIAfilter Cartridge喷嘴上。将 QIAfilter Cartridge放在一个方便的架子上。6.添加▲4 毫升或●10 毫升冷buffer P3，立即通过翻转倒置4 — 6次彻底地混合直接转到步骤 7。不做冰浴（与标准中提不同）。冰冻的buffer P3增强反应效率。buffer P3使蓬松的白色裂解产物变得不那么粘。沉淀的材料包含基因组 DNA、蛋白质、细胞碎片和 KDS。裂解物应彻底混合确保钾十二烷基硫酸盐沉淀。如果混合物仍会出现粘稠，需要更多翻转混合。如果已使用了 LyseBlue 试剂，混合直到所有蓝色的痕迹都消失。7.反应物全部倒入QIAfilter Cartridge。在室温下 (15-25 ° C) 静置10 分钟。不要插入柱塞!重要：这 10 分钟孵化在室温是必不可少的。含蛋白质、基因组 DNA 和洗涤剂沉淀将浮于上层。这可确保过滤时无堵塞。如果 10 分钟后沉淀没有漂浮到顶部，仔细用无菌吸管头吸取下面的沉淀。8.竖直放置▲QIAGEN-tip 100或●QIAGEN-tip 500，加入▲4 毫升或●10 毫升QBT buffer，使其自由流空。9.移除QIAfilter Cartridge喷嘴处的盖子。轻轻地插入柱塞到▲ QIAfilter Midi 或● QIAfilter Maxi Cartridge，挤出裂解产物到。直到所有的裂解产物的通过