10.冻存与复苏、细胞计数要点.pptVIP

细胞冻存与复苏技术 细胞计数 许重洁 xcj029@163.com 细胞工程教研室 细胞冻存及复苏 实验目的 实验原理 实验方法 注意事项 作业与思考 一、实验目的 1 .掌握细胞冻存与复苏的原理。 2.掌握细胞计数的一般方法。 3 .熟悉体外培养细胞液氮冻存技术及冻存细胞的复苏技术。 二、实验原理 冻存与复苏  实验原理 冻存与复苏中的损伤 直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、脱水、蛋白变性等，能引起细胞死亡。 1.冰晶的损伤 2.溶质的损伤 （一）冷冻保护液 如向培养液加入保护剂 1.可使冰点降低。 2.在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。 3. 贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。可以保护一些重要的蛋白质和细胞器的功能。 ?? 目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油。它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。 （二）慢冻和快复 1.慢冻：在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。 2.快复：细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－50～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。 在低温下，细胞内酶活性停止，代谢停止，细胞处于休眠状态，可以长期保存。 普通冰箱 4一-20℃ 超低温普通冰箱 -80℃ 液氮罐 -196℃ 三、实验方法 （一）慢冻1.将1 ml鸡血细胞悬液收集至离心管中，加5ml生理盐水。2.1000rpm离心10min，弃上清液。3.沉淀加5 ml冻存液，重悬。4.将悬液分至冻存管中，每管1 ml。5.将冻存管口封严。 培养细胞的冻存技术 实验方法 6.将冻存瓶或安瓿装入小布袋中，用棉线扎紧，挂上标签。 7.布袋悬吊于液氮罐口内的气液氮中放置5-10min，迅速浸入液氮（-196℃）中。 培养细胞的冻存技术 离心机使用 水平放置 配平（等质量对称放置） 转子拧紧，盖紧后启动 自行减速停止 保持清洁 （二）快复 1.从液氮中取出冻存管、迅速置于37℃水浴箱中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1min之内融化。2.打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。3.1000rpm离心10min，弃去上清液。4.沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10min，弃上清液。  5.染色：吸取1ml细胞悬液放入干净试管中，再加0.4％台盼蓝染液0.5ml，用吸管轻轻吹打混匀，染色2min（时间不能延长否则活细胞也被染上色）。 6.计数：用记数板计算细胞活力。染上蓝色的为死细胞，透明未染上的是活细胞。 （三）细胞活力测定实验操作 计数板由一块长约7.5cm，宽3.5cm的厚玻璃制成，有前后两个计数室。计数室与盖玻片的距离为0.1ml，每个计数室分九大格，各格边长为1mm，每格面积则为1mm2，四角的大格被划分为16个中方格；中央的大格划分为25个中方格，每个中方格又被划分为16个小格。盖上盖玻片于计数室上，将计数板放到显微镜的载物台上，用低倍镜观察熟悉计数板。 血细胞计数板的构造 1.滴片：将擦干净的计数板放回实验台面上，用吸管吸取试管中已染色的细胞悬液（注意吸前混匀），滴在计数板上盖玻片边缘，让细胞悬液自然流入计数室内（注意滴加的量不要过多或过少，计数室内不应有气泡存在，否则会影响计数结果），静置2min让细胞下沉后便可在显微镜下观察计数。 2.计数：将计数板放到载物台上，在低倍镜下按一定方向（如顺时针）逐格数出计数室四角的每个大格内的活、死细胞个数。若细胞正好压在格线上，则按数上不数下、数左不数右的原则计数。 3.计算：如计培养细胞总数则按下式求出每毫升悬液中的细胞数。 四大格的细胞总数 细胞总数（个/ml）= ×10000×稀释倍数 4 注：1ml＝1000mm3，每大格的体积为0.1mm3，故式中乘以10000便等于每毫升悬液中的细胞数。 如计算细胞活力则按下式求出细胞活力 四大格的活细胞总数 细胞活力＝───────