原位杂交技术重点.ppt

原位杂交技术 时间：2015年10月14日 一、定义 二、基本原理 三、分类 四、基本过程 五、技术的应用 一、原位杂交技术的定义 原位杂交技术（In situ hybridization，ISH）是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程 二、原位杂交技术的基本原理 利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来 三、原位杂交技术的分类 1、基因组原位杂交技术 利用物种之间的DNA同源性的差异，用另一物种的基因组DNA以适当的浓度做封阻，在靶染色体上进行原位杂交 2、荧光原位杂交技术 在已有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性DNA分子原位杂交技术。它利用荧光标记的核酸片段为探针，与染色体进行杂交，通过荧光显微镜检测信号DNA序列在染色体或者DNA显微切片上的目的DNA序列，进而确定其杂交位点。 优点：检测时间短，灵敏度高，无污染 3、多彩色荧光原位杂交技术 是在荧光原位杂交技术的基础上发展起来的一种新技术，它用几种不同颜色的荧光素单独或混合标记的探针进行原位杂交，能同时检测多个靶位，各靶位在荧光显微镜下和照片上的颜色不同，呈现多种色彩， 优点：能同时检测多个基因 4、原位PCR 原位PCR技术是常规的原位杂交技术与PCR技术的有机结合，即通过PCR技术对靶核酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使其拷贝数增加，然后通过原位杂交技术进行检测，从而对靶核酸序列进行定性、定位和定量分析 优点：大大提高了原位杂交技术的灵敏度和专一性，可用于低拷贝甚至单拷贝的基因定位 三、原位杂交技术的一般过程 杂交前准备 以经过标记的已知核酸分子为探针 使探针与靶核酸分子在原位发生杂交 进行探测 四、原位杂交技术的基本步骤 1、杂交前的准备 包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核算探针的穿透性、减低背景染色等 （1）固定：最大限度的保持细胞内DNA和RNA的水平，常用的固定剂是多聚甲醛 （2）取材：组织在取材后可以用液氮冷冻 （3）组织处理：ISHH实验周期较长需要用粘附剂处理，常用的是铬矾明胶液和多聚赖氨酸 （4）增强穿透性：用某些消化酶例如：胃蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉酶等使得组织广泛的去蛋白可以增强组织的通透性和核算探针的穿透性 （5）减低背景染色：杂交后的酶处理和杂交后的洗涤有助于减低背景染色 2.标记探针的准备 对cDNA、RNA和寡核苷酸三种探针的选择，要考虑所要检测的靶核酸分子的性质，如cDNA 和RNA 适宜于检测mRNA分子，寡核苷酸对mRNA的杂交效率和特异性都不如RNA探针。 3、杂交 杂交是在一定温度和离子强度条件下让标记探针与组织中靶分子结合的过程。将杂交液体滴于切片的组织上，加盖硅化的盖玻片用以防止杂交夜的挥发 探针的浓度：非放射性标记探针浓度为0.5-5.0ng/ul，放射性标记的探针浓度在2-5ng/ul 必须强调的是加杂交液的量要适度，以10- 20ul每张切片为宜 4.杂交体探测 根据探针标记物的不同采用放射自显影方法或免疫细胞化学方法显示杂交结果。 放射自显影可以利用人工或者计算机辅助的图像分析检测仪进行检测 非放射性核酸探针杂交的细胞或者组织可以利用酶检测系统显色，然后利用显微分光光度计或者图像分析仪对不同类型和数量的核算显色强度进行检测 五、原位杂交技术的应用 ①细胞特异性mRNA转录的定位，可用于基因图谱，基因表达和基因组进化的研究 ②感染组织中病毒DNA/RNA的检测和定位 ③癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的检测 ④基因在染色体上的定位 ⑤检测染色体的变化，如染色体数量异常和染色体易位等 ⑥分裂间期细胞遗传学的研究，如某些肿瘤的诊断和生物学剂量测定等