原位杂交2(修改稿)课件.pptVIP

v.显示 1、碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体 Fab片段（1：1000）室温下孵 育1h。 2、0.05 mol/L PBS (pH 7.2)冲洗 4次，每次5 min。 3、TSM2冲洗2次，每次5 min。 4、TSM2冲洗2次，每次5 min。 5、NBT和BCIP显色液中显色3h(室温 )。 6、0.05 mol/L PBS冲洗2次，每次5 min 7、脱水、透明、封片。 （三）吸收试验 将无标记探针先同特异性与之互补的DNA或RNA预杂交，然后再进行原位杂交，结果应为阴性。 三、杂交反应对照 （一）空白试验 在进行原位杂交时，将杂交液中省去标记探针，结果应为阴性。这是一项简便而有意义的阴性对照。 （二）杂交前用核酸酶预处理标本 根据靶核酸是DNA或RNA，对被检测的标本先用DNA酶或RNA酶进行预处理以消化被检测的核酸，然后再进行原位杂交。与未经DNA酶或RNA酶预处理的标本相比，如果杂交信号明显减弱，便证明标记探针与未经酶预处理标本中的DNA或RNA之间有杂交体形成。 四、显示系统对照 （一）放射自显影显示系统对照 阳性对照是将浸渍乳胶的空白片在光线下曝光后显影，阳性结果证明乳胶及显影过程工作正常。 阴性对照是将空白片浸乳胶后不经曝光便与原位杂交标本一起进行显影，结果应为阴性。 如果阴性对照照片上有较多的银粒，则说明乳胶有放射性污染。 （二）非放射性原位杂交显示系统对照 绝大部分的非放射性原位杂交是以免疫组织化学方法进行显示的，在对照试验中应包括免疫组织化学的一系列阳性对照和阴性对照。具体对照试验的种类、操作方法与结果分析请参阅有关篇章或免疫组织化学专著。 第九节??? 原位杂交组织化学常用操作程序 一、应用放射性同位素标记的寡核苷酸探针 （一） 取材和切片 1、 取材 （1）新鲜组织速冻法：将动物麻醉后断头，迅速取材，并立即以干冰或液氮速冻10～20min。 （2）灌注固定法：将动物麻醉后，经心脏先灌注温生理盐水，再以4％甲醛－0.1mol/L磷酸缓冲液（PB，pH 7.2）灌注固定，取材并浸于同样固定液中再固定2～4h，然后将取材浸入20％蔗糖－PB于40C冰箱过夜。 2、?切片 将速冻的组织或灌注固定的组织在恒冷箱切片机中切片（厚15～20μm）。将切片贴于有粘胶剂的载玻片上，37℃或室温干燥以增加切片的粘附性。如不立即进行杂交处理，可将切片储藏于－20℃～－80℃的环境中（可保存数月）。 （二）杂交前处理 1、4％ 多聚甲醛－0.1mol/L,PB （pH 7.2）固定30～60min（进 一步固定mRNA）； 2、0.1mol/L PB（pH 7.2）清洗3 次(每次5min)。（用磷酸缓冲 液冲洗） 3、0.1mol/L,甘氨酸-0.1mol/L PB（pH 7.2）洗 5min。 4、0.3% Triton X-100 -0.1mol/L PB （pH 7.2）处理洗10-15min(室温)。 5、1μg/ml蛋白酶K （pH 8.0的TB缓冲 液配制）消化30 min（37℃）。 （消化充分暴露） 6、4％ 多聚甲醛－0.1mol/L,PB（pH 7.2） 终止消化和再固定（5min）。 7、0.1mol/L,PB（pH 7.2）冲洗2次，每次3min。 8、0.25％乙酸酐（以pH 8.0的0.1mol/L三 乙酸酐配制）处理10min。（碱性蛋 白乙酰化，去阳离子电荷） ???? ??9、4×SSC 5min。（从高浓度 　低浓 度用标准枸椽酸盐洗掉乙酰酐） 10、2 ×SSC 10min。 11、70～100％梯度酒精脱水，每次3min。 12、氯仿脱脂10min后干燥。 i.杂交 1.配制杂交液： 在Eppendorf管中加入下列液体： 标记探针 0.1～1.0 ×106 cpm/载片 杂交缓冲 300 μl/载片 2.将杂交液混匀后滴加在切片表面， 然后将载片放于密封塑料盒内杂 交20～24h（41～45℃）。 ii.杂交后冲洗 1、4×SSC 10sec