GFP荧光标记GLP-1受体细胞系的建立.doc

GFP荧光标记GLP-1受体细胞系的建立 百度搜索“就爱阅读”,专业资料,生活学习,尽在就爱阅读网92,您的在线图书馆生命科活GLP-1性较类似物已经在临床上低的GLP-1可以有效的应用。 (9-36),地延近年来因此极大地限长GLP1,通过合成的作用时间GLP-1制了 [7,8]。 目前,GLP1类似物如exendin-4已上市,但是存在价格高昂,只能皮下注射,长期用药易产生药 物抵抗的问题。此外,exendin-4存在一定的副作 用,如导致胰腺炎[9]寻找小分子口服、副,其中作用具较体小机的制GLP-1尚不清楚类似物。 因此成为当前的发展方向之一。 本实验构建了GFP(greenfluorescentprotein)标记的GLP-1R稳定转染细胞株,并对该细胞模 型进行了验证,利用云南丰富的天然药物资源,以期从大量的天然药物资源中筛选出与GLP-1R有作用的小分子化合物。 1 材料和方法 1.1 材料 分子克隆所需的胰蛋白胨(tryptone)、酵母提 取物(yeastextract)及琼脂糖均购自英国Oxoid公司;ExTagDNA聚合酶和T4DNA连接酶等工具酶购自日本Takara公司;限制性内切酶(Sgf玉、Mlu玉)购自加拿大Fermentas公司;凝胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒均购自北京索来宝公司;去内毒素质粒大提试剂盒购自美国OMEGA公司;菌株E.coliDH5琢和U2OS细胞株由本教研室保存;细胞培养所用的DMEM培养基和胎牛血清购自美国HyClone公司,细胞培养瓶和培养板购自美国Costar公司,转染试剂lipofectamine2000购自resco公司Invitrogen;工具中药国Exendin公司,G4184购自购自美国美礼来国公司Am原,pCMV6-AC-GFP抗Exendin体购自9-39英国购自Abcam阿拉丁公上司海;公司真核;人表GLP-1R 达载体剂均为国产或进口购自分析纯试剂美国Origene。公司;其他试 方法引物引物设计 设计采用Primerpremier5.0软件完成。 CCCGGC其上游引物-3忆:;5下忆-gaggcgatcgcc游引物:5忆ATGGCCGGCGCC-gcgacgcgtGCTG下游引物5忆端加上了Sgf玉、。分Mlu别玉在上酶切游位点引物和和- 原 CAGGAGGCCTGGCAAG-3忆3 个保护碱基(gag,gcg),并在起始密码前另加了C,引物由硕阳科技有限公司合成。 学研究圆园15年 1.2.2 以人人GLP-1RGLP-1RcDNAcDNA为扩模增 板,采用PCR的方式 扩PCR增全50长人滋LGLP-1R反应体cDNA系中加编码区入cDNA,全长模1板3921bp滋L, 。10上下伊ExH游Taq引物Buffer(10pmol/L)5滋L,各dNTP1滋L,(2.5Exmmol/L)Taq酶31滋滋L,L,952O益补变足性至4550s,滋65L;反益应退火条件45为:s,95伸72益10益预min延变伸性。琼脂15min,min;共进行30个循环;72益继续延糖 1.2.3 电泳鉴人定GLP-1RPCR产物真核表达载体构建 。 将上述PCR产物和pCMV6-AC-GFP质粒 分10别DNAg/L用连琼脂限制接酶过糖性凝胶内切夜连电泳酶Sgf接分后离玉转、胶回收和Mlu玉化E.coli纯双DH5化酶琢,切经后感T4, 态,氨苄青霉素筛选培养,挑取阳性克隆扩增后受 ,提取1.2.4 质粒U2OS稳定进行细胞转染人酶切和在含GLP-1RDNA测序鉴10%(体的积U2OS定。分数)细胞胎牛系血建立 DMEM清的 饱Lipofectamine和湿度培养基下培养中,。于待37细胞益、融5%合(至体积90%~95%分数)CO时2的按 GFP2000操作说明书进行pCMV6-AC-染(40048和h重组后,表达用胰蛋白酶载体GLP-1R/pCMV6消的转染。转抗生素滋g/mL)抗性的的选阳择性培养基细胞克隆中化细胞筛选,扩增两周,在培养,含获得有G418即为具有稳定1R/U2OS表达人GLP-1R细胞。 的U2OS细胞系,命名为GLP- 1.2.5收Western-blot集转染细胞检测,裂解GLP-1R后取40翻译水平滋g处理的表达 后的蛋 白样品进行SDS电泳并电转移至PVDF膜上,50g/L脱脂奶粉室温封闭振荡2h,与1︰200稀释后的一抗4益孵育过夜,PBST洗膜3次,每次10min,然后与1︰5000稀释后的HRP标记DAB的二抗显色检室温孵育测目2h,PBST洗膜3次,每次10min, 1.2.6 GLP-1R/U2OSGLP-1R/U2OS的蛋白。细胞细胞株按每孔GLP-1R100滋L活(1性分析 胞/孔)培养于96孔培养板